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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.19  supl.2 Santiago  2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182002019200005 

Detección de ß-lactamasas de espectro extendido
en el laboratorio de microbiología

Raúl Zemelman Z1,2, Lissette Valenzuela G.1, Mariana Domínguez Y1, Helia Bello T1,
Gerardo González R1 y Claudia Zemelman M1

DETECTION OF EXPANDED-SPECTRUM BETALACTAMASES
IN THE MICROBIOLOGY LABORATORY

Key words: Betalactamases, Expanded spectrum.

Introducción

La actividad de ß-lactamasas constituye el principal mecanismo de resistencia de las bacterias a los antibióticos b-lactámicos.1 La actividad de estas enzimas está dirigida específicamente a la hidrólisis de la unión b-lactama del anillo b-lactámico, provocando la producción de un compuesto ácido carente de actividad antibacteriana. El uso de una importante cantidad de nuevos antibióticos b-lactámicos contribuyó, a través de varias décadas, a la selección de bacterias Gram positivas y Gram negativas que producen una o más de estas enzimas.

Una importante proporción de las b-lactamasas descritas hasta este momento es codificada por genes de ubicación plasmidial. Específicamente, en bacilos Gram negativos, las b-lactamasas de los grupos TEM (especialmente en Escherichia coli) y SHV (especialmente en Klebsiella pneumoniae) son las más frecuentes. Las enzimas originales o parentales que han dado origen a ambos grupos corresponden a las b-lactamasas TEM-1, TEM-2 (grupo TEM) y SHV-1 (grupo SHV). Estos tres tipos de b-lactamasas pueden hidrolizar bencilpenicilina, aminopenicilinas (ampicilina y amoxicilina), carboxipenicilinas (carbenicilina y ticarcilina) y ureidopenicilinas (entre ella piperacilina) pero no manifiestan acción hidrolítica importante sobre cefalosporinas. Sin embargo, el uso de estos últimos compuestos ha favorecido la selección de cepas bacterianas que producen nuevas variedades de b-lactamasas de los grupos TEM y SHV pero que, ahora, tienen la propiedad de hidrolizar cefalosporinas de tercera generación (CF3G). Estas novedosas e importantes b-lactamasas han sido denominadas b-lactamasas de "espectro extendido" (BLEE).2 Se han descrito más de 40 variedades de b-lactamasas TEM y más de 10 variedades de b-lactamasas SHV con espectro extendido. La resistencia que determinan estas enzimas no es elevada y las cepas productoras pueden, incluso, aparecer susceptibles o medianamente resistentes a estos antimicrobianos en los exámenes de laboratorio. Sin embargo, pueden ocurrir fallas terapéuticas durante el empleo de CF3G en infecciones causadas por estos microorganismos. Por esto, la constatación de la presencia de una de estas enzimas obliga al microbiólogo a informar resistencia a cefalosporinas de tercera generación.

Las BLEE, como enzimas plasmídicas, son eficientemente inhibidas por ácido clavulánico (AC), propiedad que ha llevado al diseño de metódicas para detectarlas por la producción de un fenómeno sinérgico entre una CF3G, por ejemplo ceftazidima o cefotaxima, y AC en ensayos por difusión en agar usando discos con estos compuestos.3 En los últimos años se han descrito también bacilos Gram negativos que producen b-lactamasas refractarias a la inhibición por AC,4 enzimas que han sido denominadas, en su conjunto, b-lactamasas IRT (inhibi-tor resistant TEM). Otro problema adicional relacionado con la pesquisa de BLEE en el laboratorio es la presencia de cepas de bacilos Gram negativos que producen b-lactamasas del tipo AmpC. Estas son enzimas con carácter de cefalosporinasas, originalmente descritas como de origen cromosomal y con síntesis inducible, pero que ahora aparecen codificadas por genes plasmidiales.5 Es importante también que estas b-lactamasas sean investigadas en el laboratorio. Las principales propiedades de las cepas bacterianas que producen estas novedosas enzimas son la resistencia a cefalosporinas, incluyendo las de primera generación y la refractariedad de esta resistencia a AC. En la Tabla 1 se resumen los diferentes tipos de b-lactamasas junto a sus propiedades principales. En base a estas propiedades, se sugiere el empleo del antibiograma por difusión en agar como método que permite deducir el potencial contenido en b-lactamasas más frecuentes en cepas de bacilos Gram negativos de aislamiento rutinario en el laboratorio de bacteriología.

  Generalidades sobre los métodos de
detección de BLEE

Existen diferentes técnicas mediante las cuales se puede deducir la presencia de una BLEE, los que se basan en la capacidad del AC para incrementar la actividad de una CF3G gracias al efecto inhibitorio que este compuesto ejerce sobre las BLEE.

  • En el año 1998, el NCCLS recomendaba el método de difusión y su aplicación al estudio de sinergia entre CF3G y AC descrito por Jarlier et al,3 que consiste en efectuar una prueba de susceptibilidad a CF3G (ej. cefotaxima y/o ceftazidima) colocando discos conteniendo estos antimicrobianos y un disco con AC (en su defecto, un disco con amoxicilina/ácido clavulánico) conteniendo 10 µg de inhibidor, a una distancia razonable (20 mm). Si la cepa ensayada resulta ser productora de una BLEE, se produce incremento del halo de inhibición en la zona de interconexión entre la cefalosporina y el AC. En ocasiones puede ser un tanto difícil visualizar este efecto sinérgico. En aquellos casos en los que se observa resistencia a una CF3G y la prueba de sinergia resulta ser negativa, puede encontrarse presente una b-lactamasa del tipo IRT (realmente muy infrecuentes en nuestro medio) o, en su defecto, la cepa bacteriana ensayada puede poseer otro mecanismo de resistencia, por ejemplo, impermeabilidad.

Esta prueba requiere del uso de ampicilina (Amp) (10 µg), cefradina (CFR) (30 µg) o cefazolina (CFZL) (30 µg), cefotaxima (CFTX) (30 µg), ceftazidima (CFZD) (30 µg), AC (10 µg). Se recomienda ensayar también discos de AC de 20 µg. El disco de AC debe colocarse en tal forma que mantenga una distancia de 20 mm con los discos de Amp, CFTX y CFZD, con el objeto de visualizar zonas de sinergia antibacteriana entre ellos.

  • Otra alternativa adecuada para detectar BLEE es el método de Ho et al.6 Estos autores han demostrado, con mucha claridad, que la sensibilidad en la investigación de la sinergia (y por lo tanto, de BLEEs) puede incrementarse notablemente con la siguiente metodología:
  • se preparan placas de agar Mueller Hinton conteniendo AC (4 µg/ml) y placas sin AC.
  • se efectúa el antibiograma en sendas placas (con y sin AC) usando solamente discos con CE3G
  • se compara el diámetro de los halos de inhibición producidos por las cefalosporinas en las placas sin y con AC.
  • el aumento de los halos en más de 10 mm en aquellas placas con AC sugiere la presencia de una BLEE

Este método alcanza una sensibilidad superior al 95%, siendo actualmente la mejor alternativa para detectar estas enzimas.

  • Posteriormente, en el año 2000, NCCLS ha recomendado el método del doble disco, como técnica estandarizada y más reproducible. Sin embargo, este método ha sido estandarizado sólo para E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca. Se realiza como el método convencional de difusión en agar, en placas de agar Mueller-Hinton, con un inóculo Mac Farland 0,5 y ensayando 4 discos: CFZD, CFZD + AC, CFTX y CFTX + AC. Se incuba normalmente en atmósfera normal durante 16 a 18 hrs a 37ºC. Se miden los halos de inhibición en forma convencional. El aumento del halo en más de 5 mm con los discos conteniendo la mezcla de cefalosporina y AC en relación al disco de cefalosporina sola, para las dos o al menos uno de las dos cefalosporinas (CFZD o CFTX), se considera confirmatorio para la presencia de BLEE.

1 Laboratorio de Antibióticos, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción,

2 Facultad de Medicina, Universidad San Sebastián, Concepción.

Bibliografía

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3.- Jarlier V, Nicolas M H, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum b-lactama-ses conferring resistance to newer b-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and suscep-tibility patterns. Rev Infect Dis 1988; 10: 867-78.         [ Links ]

4.- Blasquez J, Baquero M R, Canton R, Alos I, Baquero F. Characterization of a new TEM-type b-lactamase resistant to clavulanate, sulbactam and tazobactam in a clinical isolate of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 2059-63.         [ Links ]

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Correspondencia a:
Raúl Zemelman Zemelman
E-mail: rzemel98@yahoo.com

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