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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.26 n.4 Santiago ago. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182009000500005 

Rev Chil Infect 2009; 26 (4): 336-341

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

 

Detección del gen blaVIM-2 en cepas de Pseudomonas aeruginosa productoras de metalo ß-lactamasa aisladas en una unidad de cuidados intensivos en Ciudad Bolívar, Venezuela

 

blaVIM-2 gene detection in metallo-ß-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa strains isolated in an Intensive Care Unit in Ciudad Bolívar, Venezuela

 

Armando Guevara, Jacobus de Waard y María Araque.

 

Universidad de Oriente, Núcleo Bolívar. Venezuela. Escuela de Ciencias de la Salud Dr. Francisco Batistini, Departamento de Parasitología y Microbiología (AG)

Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela. Facultad de Farmacia y Bioanálisis Laboratorio de Microbiología Molecular (AG, MA)

Instituto de Biomedicina, Caracas, Venezuela Laboratorio de Tuberculosis (JdW).

 

Correspondencia a:


 

Ten Pseudomonas aeruginosa strains with resistance to broad-spectrum cephalosporin and carbapenems were studied to determine the presence of genes that mediate the productionof metallo-p-lactamases. These strains were isolated from patients with nosocomial infection at the Intensive Care Unit of the Complejo Hospitalario "Ruiz y Paéz" of Ciudad Bolívar, Bolívar State, Venezuela, from 2003 to 2006. In all isolates a metallo-enzyme activity was detected by using the double disk synergism test. PCR amplification of genes encoding the families IMP, VIM and SPM metallo-ß-lactamases showed the presence of a blaVIM gene in all strains studied. DNA sequencing revealed that all isolates showed the presence of blaVIM-2These results suggest that it is necessary to keep these strains under epidemiologic surveillance, establish laboratory strategies for opportune detection and the imple-mentation of new policies to ensure the appropriate use of antibiotics in this institution.

Key words: Pseudomonas aeruginosa, metallo-ß-lactamases, blaVIM-2 gene, nosocomial infections.


Resumen

Se estudiaron 10 cepas de Pseudomonas aeruginosa con resistencia a cefalosporinas y carbapenémicos con el objeto de determinar la presencia de genes que median la producción de metalo ß-lactamasas. Estas cepas se aislaron de pacientes con infección nosocomial hospitalizados en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) del Complejo Hospitalario "Ruiz y Paéz" de Ciudad Bolívar, estado Bolívar, Venezuela, durante el período 2003 - 2006. En todas las cepas se detectó la actividad de una metalo-enzima, mediante la prueba del sinergismo del doble disco. La amplificación por la reacción de polimerasa en cadena de los genes que codifican para las metalo ß-lactamasas de las familias IMP, VIM y SPM, y su posterior secuenciación, permitió confirmar la presencia de metalo p-lactamasas de tipo VIM-2. Estos resultados sugieren que es necesario mantener bajo vigilancia epidemiológica a estas cepas, establecer estrategias de laboratorio para su detección oportuna e implementar nuevas políticas que aseguren el uso adecuado de los antibacterianos en esta institución.

Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, metalo ß-lactamasas, gen blaVIM-2 , infección nosocomial.


 

Introducción

El surgimiento de los mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos, en particular a los p-lactámicos de amplio espectro, hace difícil el manejo de los procesos infecciosos, especialmente los causados por Pseudomonas aeruginosa. En consecuencia, las opciones terapéuticas disponibles para tratar las infecciones por P aeruginosa resistente son muy limitadas y la decisión en la aplicación de un tratamiento apropiado muchas veces no se realiza con la celeridad que el caso amerita, por lo que se favorece el aumento de la morbilidad y la mortalidad en pacientes con infecciones por este patógeno1.

La producción de metalo-enzimas es uno de los mecanismos principales involucrados en la resistencia de P. aeruginosa a los ß-lactámicos de amplio espectro2. Estas enzimas, presentes de forma natural en algunas especies de bacilos gramnegativos ambientales, tienen la capacidad de hidrolizar a todas las penicilinas, cefalosporinas y carbapenémicos2,3. De acuerdo con la secuencia nucleotídica de los genes que codifican para las metalo ß-lactamasas y las características estructurales de cada enzima, éstas han sido divididas en tres subclases en el grupo B de la clasificación molecular de Ambler. La subclase Bl agrupa a las enzimas inducibles o asociadas a plásmidos. En este grupo se encuentran las de tipo IMP, VIM, SPM, GIM y SIM. Las subclases B2 y B3 agrupan las metalo P-lactamasas cromosómicas derivadas de Aeromonas spp, Serratiafonticolay Stenotrophomonas maltophilia3.

En P, aeruginosa se han detectado cuatro de los cinco tipos de metalo ß-lactamasas que constituyen la subclase Bl (IMP, VIM, SPM y GIM)3. Los genes que codifican para estas enzimas se encuentran asociados a transposones e integrones, los cuales están frecuentemente localizados en plásmidos grandes (80-120 kb), donde usualmente se transportan otros determinantes de resistencia3,4.

Las metalo-enzimas pertenecientes a la familia IMP y VIM son las más frecuentes y diseminadas en todo el mundo. En Venezuela, se reportaron por primera vez cepas de P aeruginosa productoras de VIM-2 en el año 20045. Desde entonces, en varios hospitales venezolanos se han aislado cepas de P aeruginosa con un perfil fenotípico compatible con la producción de metalo ß-lactamasas, pero en la mayoría de los casos no se ha comprobado el mecanismo genético involucrado.

Por ello en este estudio se analizaron 10 cepas de P. aeruginosa resistentes a cefalosporinas de amplio espectro y a carbapenémicos, aisladas de pacientes hospitalizados en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) del Complejo Hospitalario "Ruiz y Páez" en Ciudad Bolívar, estado Bolívar, Venezuela, con el fin de determinar la presencia de genes que median la producción de metalo ß-lactamasas.

Material y Métodos

Cepas bacterianas. Se analizó una colección de 10 cepas de P. aeruginosa con un patrón inusual de resistencia a cefalosporinas de amplio espectro y carbapenémicos, aisladas de pacientes hospitalizados en la UCI del Complejo Hospitalario "Ruiz y Páez" en Ciudad Bolívar, estado Bolívar, Venezuela, durante el periodo 2003 al 2006.

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Los fenotipos de susceptibilidad fueron determinados utilizando el método de difusión con discos de acuerdo a los criterios del Clinical and Laboratory Standards Institute6. Los antibacterianos utilizados fueron (BBL): piperacilina (100 ug), piperacilina/tazobactan (100/10 ug), ceftazidima (30 ug), cefoperazona (75 ug), cefepima (30 ug), imipe-nem (10 ug), meropenem (10 ug), aztreonam (30 ug), amikacina (30 ug), gentamicina (10 ug) y ciprofloxacina (5 ug). La cepa P, aeruginosa ATCC 25927 se utilizó como control para las pruebas de susceptibilidad.

Detección fenotípica de las metalo ß-lactamasas. Esta prueba se realizó mediante la técnica de sinergismo del doble disco (DDST), utilizando discos de imipenem (10 ug), meropenem (10 ug) y ácido etilendiaminotetracético-mercaptoacético de sodio (EDTA-SMA) (Fluka). Los discos de EDTA-SMA fueron preparados de acuerdo a lo descrito por Lee y cois7. Se impregnaron discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro con 10 mi de una solución que contenía 4 volúmenes de EDTA (0,5 M) y 6 volúmenes de SMA (300 mg/ml), obteniéndose una concentración final en cada disco de aproximadamente 750 ug de EDTAy 2 mg de SMA. Una vez elaborados los discos, se dejaron secar a temperatura ambiente y fueron conservados a -20 °C.

La detección de las metalo ß-lactamasas se realizó inoculando placas de agar Mueller-Hinton (HiMedia) con suspensiones de las cepas ajustadas a una turbidez equivalente al 0,5 de McFarland. Luego, se colocó el disco de EDTA-SMA en el centro de la placa y a ambos lados, a una distancia de 15 mm, se ubicaron los discos de imipenem y meropenem. Las placas fueron incubadas a 35 °C en aerobiosis durante 18-24 horas y posteriormente se procedió a la lectura e interpretación de la prueba. Se consideró la prueba positiva para la producción de una metalo ß-lactamasa, cuando fue visible el incremento del halo de inhibición entre el ß-lactámico (meropenem y/o imipenem) y el disco de EDTA-SMA7.

Como control de los discos de EDTA-SMA y de las pruebas de detección fenotípica de las metalo-enzimas, se utilizó la cepa P. aeruginosa 77297 productora de metalo P-lactamasas de tipo VIM.

Extracción del ADN cromosoma! de las cepas de P. aeruginosa. A partir de un cultivo de 18 horas en agar tripticasa soya (HiMedia) se tomaron varias colonias, se resuspendieron en 200 ul de TE (lOmM Tris, 1 mM EDTA) y se sometieron a ebullición en baño de María por 10 minutos. Posteriormente, por centrifugación, se separó el sobrenadante conteniendo el ADN bacteriano, el cual se transfirió a tubos Eppendorf y se almacenó a -20 °C8.

Detección por RPC de genes que codifican para las metalo fi-lactamasas. La presencia de los genes que codifican para las metalo ß-lactamasas de las familias SPM, VIM e IMP, se realizó a través de la reacción de polimerasa en cadena (RPC) utilizando los partidores mostrados en la Tabla 1. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 ul y la mezcla estuvo compuesta por 5 ul de cada partidor (5 pmol/ml); 20,5 mi agua bidestilada ultrapura; 25 ul LPU (Fundaim) y 2,5 mi de ADN. Las condiciones de amplificación fueron las descritas anteriormente8-10. Los productos obtenidos de las amplificaciones por RPC fueron observados en corridas electroforéticas en geles de agarosa al 1,5% (Promega), teñidos con bromuro de etidio (Sigma) y fotografiados con una cámara digital PowerShot A700 (Canon). Como marcador del tamaño molecular se utilizó Ladder 50 pb (Promega).

Secuenciación de los productos amplificados. Los productos de la RPC que resultaron positivos para la detección de genes que codifican para las metalo ß-lactamasas se purificaron utilizando el Wizard® DNA Clean-Up System (Promega). Posteriormente, las secuencias nucleotídicas fueron determinadas por el Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos (CeSAAN) del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Caracas-Venezuela, mediante electroforesis capilar en un secuenciador de ácidos nucleicos modelo ABI 3130XL (Applied Biosystems®), utilizando los mismos partidores que en la RPC. Las secuencias nucleotídicas resultantes fueron analizadas mediante el uso del programa Basic Local Alignment Search Tool (BL AST) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) y comparadas con las secuencias génicas incluidas en la base de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).

Resultados

Se evaluó un total de 10 cepas de P aeruginosa, resistentes a las cefalosporinas de amplio espectro y a los carbapenémicos, aisladas de muestras clínicas de pacientes hospitalizados en la UCI. Los pacientes tenían una edad promedio de 34 años (rango: 2-55 años), el 30% correspondió al sexo femenino y 70% al masculino. Las cepas fueron recuperadas de cuatro muestras de secreción intra-abdominal, tres de aspirado traqueobronquial, dos de sangre y una de la secreción del orificio de yeyunostomía. Todos los pacientes fueron tratados con la combinación de diferentes grupos de antibacterianos, siendo común el uso de ß-lactámicos de amplio espectro y aminoglucósidos. En tres pacientes se incluyó imipenem en el esquema terapéutico. Dos de ellos fallecieron (Tabla 2).

En la Tabla 3 se muestran las características fenotípicas de las cepas estudiadas. La mayoría de las cepas fueron resistentes a los ß-lactámicos, sensibles al aztreonam y con resistencia asociada a aminoglucósidos (gentamicina y amikacina) y a ciprofloxacina. Este fenotipo fue el más frecuente y constituyó el patrón A. La cepa 1100H constituyó el patrón B y se diferenció del Apor demostrar sensibilidad intermedia a gentamicina y ciprofloxacina. Independientemente del patrón fenotípico de resistencia, todas las cepas produjeron metalo ß-lactamasas de acuerdo a la prueba DDST. Este resultado fue confirmado cuando se utilizaron los ensayos para la detección genética de las principales familias de metalo-enzimas. Las 10 cepas con fenotipos compatibles con la producción de metalo ß-lactamasas amplificaron solamente con los iniciadores específicos para la detección del gen blavm (Tabla 3 y Figura 1). La secuenciación de los amplicones permitió identificar la presencia del gen blavm 2en todas las cepas estudiadas.

 

Discusión

La prevalencia de cepas de P aeruginosa productoras de metalo p-lactamasas en áreas hospitalarias como las UCI, se ha incrementado en los últimos años en todo el mundo11-13. Las cepas de P aeruginosa que se analizaron en este estudio, fueron aisladas en pacientes con diagnósticos diferentes que posteriormente se complicaron con una infección nosocomial en la UCI del Complejo Hospitalario "Ruiz y Páez" en Ciudad Bolívar. Al realizar las pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos se observó que todos los aislados mostraron un perfil de sensibilidad compatible con la producción de una metalo ß-lactamasa. La detección de este tipo de enzimas mediante los ensayos DDST permitió confirmar que todas las cepas de P aeruginosa aisladas producían una metalo-enzima.

En todos los aislados se pudo observar que la resistencia a los ß-lactámicos de amplio espectro estuvo siempre asociada a la presencia de otros marcadores tales como: gentamicina, amikacina y ciprofloxacina. Se ha confirmado que las metalo ß-lactamasas de la subclase B1, son codificadas por genes localizados en transposones o integrones que se encuentran en plásmi-dos transferibles, donde, por lo general, co-existen otros determinantes de resistencia3414. La presencia de genes de resistencia adicionales que median la producción de enzimas modificadoras de aminoglucósidos, bombas de expulsión, alteraciones de la permeabilidad de la pared celular entre otros, son mecanismos que pueden expresarse simultáneamente en P aeruginosa1516, generando así diferentes complejos fenotípicos de multi-resistencia como los observados en este estudio.

Aztreonam no es afectado por la acción de las metalo ß-lactamasas y representa una opción terapéutica en el tratamiento de las infecciones por P aeruginosa productoras de metalo-enzimas11. Las cepas estudiadas conservaron la sensibilidad a este antibacteriano. Las metalo ß-lactamasas de tipo IMP fueron las primeras en ser identificadas en bacterias gramnegativas, son las más frecuentes y diseminadas en todo el mundo. A éstas le siguen en importancia las pertenecientes a la familia VIM, cuyas variantes se han detectado desde 1997 en varios países de Europa31114. En Venezuela, la metalo ß-lactamasa VIM-2 fue descrita en el año 2004 en tres cepas de P aeruginosa de origen clínico en un hospital de Caracas, en el marco del programa internacional de vigilancia SENTRY (Antimicrobial Surveillance Program)5.

El presente trabajo representa el primer reporte donde se confirma la presencia de cepas de P. aeruginosa productoras de metalo ß-lactamasas de tipo VIM-2 aisladas de pacientes internados en un hospital público en la región sur oriental del país.

Es importante destacar que en este estudio también se investigó la presencia de otras metalo ß-lactamasas, como las de la familia IMP y SPM, resultando negativo. La primera de éstas ha aumentado su prevalencia en América en los últimos años y las metalo ß-lactamasas SPM son prevalentes en el norte de Brasil17. Este último dato es de particular interés epidemiológico para el estado Bolívar, debido a que en el Complejo Hospitalario "Ruiz y Páez" en Ciudad Bolívar se atienden pacientes provenientes de la parte norte del Brasil, zona fronteriza con el estado Bolívar. Por lo tanto, no es de sorprender que en algún momento se aislen en este hospital cepas de P. aeruginosa productoras de metalo ß-lactamasas de tipo SPM con un alto riesgo de diseminarse, de no tomarse medidas de vigilancia, control y prevención precoz contra este patógeno.

La evolución de los genes que median la resistencia a los antimicrobianos ß-lactámicos de amplio espectro en P aeruginosa, está particularmente relacionada con el uso de imipenemy a la aparición de brotes o epidemias en áreas específicas del ambiente hospitalario12,18,19. En Venezuela, el listado oficial de medicamentos para el uso hospitalario sólo incluye imipenem como único representante de los carbapenémicos20, lo que favorece su prescripción intensa en lugar de otras alternativas terapéuticas efectivas. Es probable que las cepas de P aeruginosa resistentes a cefalosporinas y carbapenémicos que inicialmente fueron aisladas en el año 2003, hayan sido seleccionadas por el uso intenso del imipenem, permitiendo de esta manera la dispersión y circulación de clones productores de metalo ß-lactamasas tipo VIM-2 durante los años 2004 al 2006. Estudios posteriores incluirán otras técnicas moleculares que determinarán el origen y la relación clonal de las cepas estudiadas.

En conclusión, los resultados de este estudio confirmaron que en la UCI del Complejo Hospitalario "Ruiz y Páez" en Ciudad Bolívar, circulan cepas de P aeruginosa productoras de metalo ß-lactamasas de tipo VIM-2. Por consiguiente, es necesario mantener a estas cepas bajo vigilancia epidemiológica, establecer estrategias de laboratorio para su detección oportuna, e implementar nuevas políticas que aseguren el uso adecuado de los antimicrobianos en esta institución. El reconocimiento de los factores asociados con el incremento de la resistencia y el estudio de los mecanismos genéticos involucrados conducirán a la aplicación de conductas que reducirán la selección y diseminación de cepas de P aeruginosa productoras de metalo ß-lactamasas.

 

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Recibido: 30 de junio de 2008 Aceptado: 7 de abril de 2009

 

Correspondencia a:
María Araque
araquemc@ula.ve

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