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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.26 n.6 Santiago dic. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182009000700001 

Rev Chil Infect 2009; 26 (6): 495-498

Artículo Original

 

Análisis retrospectivo del rendimiento de Amplicor-PCR® para la detección de Mycobacterium tuberculosis en muestras respiratorias y no respiratorias con baciloscopia negativa

Assessment of the Amplicor PCR® for the detection of Mycobacterium tuberculosis in smear negative respiratory and non respiratory specimens: A retrospective analysis

 

Carolina Selman B., Helena Poggi M., Juan C. Román, Patricia García C. y Marcela Lagos L.

Laboratorio de Biología Molecular, Departamento de Laboratorios Clínicos, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago.

Dirección para correspondencia


Resumen

Introducción: Los métodos comerciales de reacción de polimerasa en cadena (RPC) están validados para el diagnóstico de Mycobacterium tuberculosis sólo en muestras respiratorias con baciloscopia positiva. En muestras con baciloscopia negativa, la sensibilidad es variable. Objetivo: Evaluar el comportamiento de la RPC en uso en muestras con baciloscopia negativa. Método: Se compararon los resultados de 235 muestras analizadas por cultivo en agar Loewenstein-Jensen ("estándar de oro") y RPC (AMPLICOR MTB test®, Roche). Resultados: Se analizaron 181 muestras respiratorias y 54 muestras extra-respiratorias. La sensibilidad de la RPC fue de 88 y 50%), respectivamente, la especificidad y el VPP fueron, en ambos casos, de 100%o, y el VPN fue de 99,4%o en muestras respiratorias y de 96,1%) en extra-respiratorias. Conclusiones: El buen desempeño de esta RPC en muestras respiratorias con baciloscopia negativa permite al médico clínico tomar decisiones en base al resultado de este examen, fundamentadamente. En muestras extra-respiratorias, sólo pueden sacarse conclusiones frente a resultados de RPC positivos.

Palabras clave: Reacción de polimerasa en cadena, pruebas diagnósticas moleculares, Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis.


Background: Commercial polymerase chain reaction (PCR) kits are widely accepted for analysis of smear positive respiratory specimens, but the sensitivity is variable for smear negative ones. Objective: To assess the PCR method usefulness in smear negative respiratory and non respiratory specimens. Methods: We compared the PCR results (AMPLICOR MTB test™, Roche) of 235 specimens subjected to culture in Loewenstein-Jensen agar (as the gold standard). Results: 181 (76%) were respiratory and 54 (24%) extra-respiratory specimens. The sensitivity was 88%) and 50%>, respectively, specificity and PPV was 100%> in both cases. NPV was 99.4%> in respiratory specimens and 96.1% in non-respiratory specimens. Conclusions: The good performance of this PCR in smear negative respiratory specimens allows the clinician to take decisions based on the result of this exam. In extra-respiratory specimens the contribution is important only when the PCR result is positive.

Key words: Polymerase chain reaction, molecular diagnostic testing, Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis.


 

Introducción

La enfermedad tuberculosa, tanto respiratoria como extra respiratoria, es producida principalmente por Mycobacterium tuberculosis, especie perteneciente a la familia Mycobacteriacea, género Mycobacterium12. Esta bacteria es un bacilo ácido-alcohol resistente, aerobio estricto y de crecimiento lento, que forma parte del "Complejo Mycobacterium tuberculosis", el que incluye a M. tuberculosis, M. bovis (incluida cepa BCG), M. africanum, M. microti y M. canetti.

Esta micobacteria puede ser detectada mediante la observación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) en un frotis de muestra (baciloscopia) y mediante el cultivo de colonias características en medios específicos (como por ejemplo Loewenstein Jensen). La baciloscopia se utiliza ampliamente porque es una técnica de bajo costo y rápida, pero posee el inconveniente de tener una sensibilidad que varía entre 30 y 80%>, dependiendo del tipo de muestra a analizar, los métodos de recuperación utilizados y de la población evaluada3,5. El cultivo es el método "estándar de oro", pero dado el lento crecimiento de las micobacterias, el resultado puede demorar hasta 60 días en medios sólidos y hasta 30 días en medios líquidos6,7. Estos métodos permiten la identificación a nivel de género solamente, por lo que la cepa se debe enviar a laboratorios de referencia para la identificación de especie, haciendo muy lento el diagnóstico definitivo.

La detección temprana y el adecuado manejo de los pacientes con tuberculosis (TBC) pulmonar es el principal objetivo de los programas nacionales; sin embargo el aumento de la infección por VIH y del SIDA no sólo ha generado un alza en la incidencia de la TBC8,10, sino que ha generado un cambio en su presentación clínica y de laboratorio, incluyendo un aumento de las TBC con baciloscopias negativas11. En estos casos, además de las estrategias tradicionales de detección por baciloscopia y cultivo, deben implementarse nuevos métodos diagnósticos que permitan un diagnóstico precoz, especialmente en las presentaciones respiratorias no bacilíferas y en las extra-respiratorias12.

Desde hace algunos años se encuentran disponibles nuevas metodologías para el diagnóstico de enfermedades infecciosas basadas en la detección de ADN de los microorganismos, las que en su mayoría utilizan la reacción de polimerasa en cadena (RPC)12. Durante esta reacción se produce la amplificación exponencial del material genético inicial, permitiendo el diagnóstico de infecciones causadas por microorganismos que no son cultivables in vitro, que requieren condiciones muy complejas para crecer o que presentan períodos de incubación prolongados. Dada la lentitud del cultivo de micobacterias, la RPC realizada a partir de una muestra clínica directa, utilizando un buen método de extracción de ADN, representa una buena herramienta de apoyo al diagnóstico, ya que puede arrojar resultados en menos de 48 hrs. Sin embargo, existen numerosos reportes en la literatura médica indicando que la sensibilidad de estas técnicas en algunas muestras sería inferior incluso a la de la baciloscopia13,20.

Actualmente, están disponibles distintos ensayos comerciales, basados en la amplificación por RPC para la detección del complejo M. tuberculosis que han demostrado ser más consistentes que los métodos caseros13. Uno de ellos es el ensayo AMPLICOR MTB test8 (Roche) que amplifica dirigidamente una región específica del complejo (la secuencia de inserción IS6110) y que posteriormente identifica con una sonda el fragmento amplificado utilizando un sistema de enzimo-inmunoanálisis (ELISA). Numerosas publicaciones evalúan esta prueba, la mayoría coincide en su buena especificidad (cercana a 100%)21 y en su sensibilidadenmuestras respiratorias con baciloscopias positivas (mayor a 95%)22,24. Sin embargo, existen opiniones divididas acerca de su sensibilidad en muestras respiratorias con baciloscopias negativas21 y en muestras extra-respiratorias20,21,25, lo que estaría dado por los diferentes métodos de descontaminación y lisis de micobacterias26, tratamiento de inhibidores27 y a una distribución heterogénea de las micobacterias en las muestras clínicas13,19.

El objetivo del presente trabajo es evaluar la sensibilidad y especificidad de esta RPC en nuestro centro en comparación con el método de referencia (cultivo), en muestras respiratorias y extra-respiratorias con bacilos-copias negativas.

Materiales y Métodos

Pacientes y muestras: Se revisaron los resultados de 476 muestras que ingresaron al Servicio de Laboratorios Clínicos de la Pontificia Universidad Católica de Chile (PUCCh) entre los años 2004 y 2007, para ser analizadas mediante cultivo (en agar Loewenstein-Jensen) y para detección por RPC (AMPLICOR MTB test®, Roche) a partir de la misma muestra.

Se excluyó toda muestra con baciloscopia positiva, quedando finalmente 239 muestras para análisis. También se excluyó una muestra reconocida como Mycobacterium avium y tres muestras donde el resultado de la RPC fue "no concluyente" debido a la presencia de inhibidores en la muestra (una respiratoria y dos extra-respiratorias).

Las muestras fueron divididas en dos grupos: 181 (76%) muestras respiratorias (expectoración: 6, lavado broncoalveolar: 159, aspirado bronquial: 16) y 54 (24%) muestras extra-respiratorias (líquido ascítico: 1, biopsias: 18, líquido cefalorraquídeo: 12, orinas: 8, abscesos: 4, líquido articular: 2, líquido pericárdico: 2, líquido seminal: 1, líquido pleural: 5, otras muestras: 1).

Procesamiento de las muestras: Fueron procesadas de acuerdo a los protocolos utilizados rutinariamente en el Servicio de Laboratorios Clínicos del Hospital Clínico de la PUCCh. Previo a todo procesamiento, las muestras se descontaminaron utilizando el método de NaOH28 y se cultivaron en agar Loewenstein-Jensen. Para la detección de ADN del complejoM. tuberculosis por RPC (AMPLICOR MTB test®, Roche), se extrajo el ADN de muestras respiratorias utilizando el método recomendado por el fabricante (MTB respiratory specimen preparation kit®, Roche) así como el ensayo comercial QIAgen DNeasy Blood & Tissue Kit® para las muestras de tejido1329.

Análisis estadístico: La sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictor positivo (VPP) y valor predictor negativo (VPN) fueron calculados mediante el programa Minitab30, considerando el cultivo como "estándar de oro".

Resultados

De las 181 muestras respiratorias, siete se encontraron positivas, tanto por cultivo como por RPC, y dos se encontraron positivas sólo por cultivo. No se encontraron muestras positivas sólo por RPC. Un total de 173 muestras fueron negativas por ambos métodos. La sensibilidad de la técnica para muestras respiratorias fue de 88%), la especificidad de 100%; el VPP de 100% y VPN de 99,4% (Tabla 1).

Dentro de las 54 muestras extra-respiratorias, dos se encontraron positivas tanto por cultivo como por RPC, dos se encontraron positivas sólo por cultivo; y ninguna se encontró positiva sólo por RPC. La sensibilidad del método en muestras extra-respiratorias fue de 50%o, la especificidad de 100%; el VPP de 100% y el VPN de 96,1% (Tabla 2).


Discusión

La RPC para la detección de ADN del complejo Mycobacterium tuberculosis se utiliza ampliamente en muestras respiratorias, pero también en muestras extra-respiratorias, por la rapidez con que se obtienen resultados y por la alta especificidad y sensibilidad, sobre todo en muestras con baciloscopia positiva. En pacientes conbaci-loscopia negativa, en los que se espera el mayor beneficio de una RPC para detectar M. tuberculosis, sin embargo, la sensibilidad y la especificidad de estos métodos son altamente variables. Existen numerosos estudios sobre métodos comerciales32, y también no comerciales3334, al respecto, donde se concuerda en que hay buen nivel de especificidad pero no de sensibilidad. Esto se debe a distintos factores, como por ejemplo el uso de métodos caseros versus métodos comerciales, métodos que utilizan sondas o que no las usan, distintos tipo de muestra y de pre-tratamiento de la muestra, métodos con extracción de ADN optimizados, etc.

En este trabajo se observó una buena sensibilidad en muestras respiratorias con baciloscopia negativa, cercana a 90%), lo que se acerca a los valores más altos reportados en la literatura científica33. En nuestro laboratorio, además de la extracción y purificación básicas de las muestras, se han incorporado purificaciones especiales recomendadas13,29 lo que probablemente ha contribuido a un mejor rendimiento en la recuperación de ADN de la muestra. En muestras extra-respiratorias, el rendimiento es inferior, lo que sin embargo concuerda también con la literatura científica, ya que se puede tratar de tejidos con presencia de inhibidores (dos de las tres muestras inhibidas de nuestra serie), en los que es posible que se encuentre baja cantidad de micobacterias, no distribuidas uniformemente.

Sin duda, el método de RPC en uso en nuestro laboratorio es un aporte para el médico clínico, especialmente en muestras respiratorias con baciloscopia negativa, por la alta sensibilidad, junto con valores altos de especificidad, VPP y VPN, lo que le permite al médico tratante contar con un diagnóstico precoz cuando la baciloscopia es negativa pero la clínica es sugerente. Todo esto tomando en cuenta, que debido al aumento de la infección por VIH, los cuadros son cada vez más atípicos, con menor carga bacteriana32.

La sensibilidad obtenida en muestras extra-respiratorias con baciloscopia negativa demuestra que, aunque la RPC es un aporte complementario al cultivo, la sensibilidad en estas muestras es insuficiente, por lo que debe destacarse que un resultado negativo no descarta la infección por M. tuberculosis.

La razón fundamental de evaluar esta RPC para detectar ADN de M. tuberculosis es enfatizar la importancia de conocer el rendimiento de los métodos que se utilizan localmente. Esto permite un uso racional en clínica, conociendo sus ventajas y desventajas aplicadas a la realidad local.

Agradecimientos. Especialmente a nuestro administrador del sistema de informática, Carlos Salcedo, por su paciencia y buena voluntad para buscar los datos.

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Correspondencia a: Carolina Selman Bravo c.selmanbravo@gmail.com

Recibido: 16 de abril de 2009 Aceptado: 5 de octubre de 2009.

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