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Revista chilena de infectología

versão impressa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. v.27 n.4 Santiago ago. 2010

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182010000500001 

Rev Chil Infect 2010; 27 (4): 297-301

Artículo Original

 

Genotipificación del virus papiloma humano en mujeres con adenocarcinoma cervical de la Región de La Araucanía-Chile

Human papillomavirus genotyping in cervical adenocarcinoma in the Region of La Araucanía-Chile

 

Angélica Melo A., Patricia García M., Italo Capurro V., Pablo Guzmán G., Priscila Brebi M., Carmen Ili G., Jaime López M. y Juan C. Roa S.

Universidad de La Frontera. Facultad de Medicina. Departamento de Anatomía Patológica, Laboratorio de Patología (AMA, PGM, JCR).

Universidad de La Frontera. Molecular Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Temuco, Chile (AMA, PGM, JCR).

Universidad de La Frontera. Programa Doctorado en Biología Molecular y Celular Aplicada (PBM, CIG, JLM).

Hospital Hernán Henríquez Aravena, Temuco, Chile. Unidad de Obstetricia y Ginecología (ICV).

Unidad de Anatomía Patológica-Citología (PGG).

Dirección para correspondencia


Resumen

El virus papiloma humano (VPH) es el principal factor causal del cáncer cervicouterino (CCU). Así, detectar y genotipificar el VPH es importante para conocer la frecuencia de los genotipos presentes en la región. En este trabajo se estudiaron 44 biopsias de adenocarcinoma cervical (ACC). Para la detección del VPH se empleó una reacción de polimerasa en cadena anidada dirigida al gen L1 (RPCL1), para la genotipificación viral se utilizaron enzimas de restricción (Rsa I, Dde I, Pst I) y secuenciación. Se detectó ADN viral mediante RPCL1 anidada en 100% de las biopias. Se logró tipificar 38/44 casos: 81,6% VPH 16; 13,2% VPH 18; 2,6% VPH 33 y 2,6% VPH 18/33. Conclusiones: La metodología fue exitosa para identificar el tipo viral en 86% de las biopsias. Se observó una estrecha asociación ACC-VPH, especialmente con el tipo viral 16, detectado en 81,6% de los casos tipificados.

Palabras clave: VPH, cáncer de cuello uterino, adenocarcinoma, RPC, RFLP, Secuencia.


Human papillomavirus (HPV) is the main cause of cervical cancer. Thus, HPV detection and typing becomes important in order to know the frequency of genotypes present in the region. In this paper we studied 44 biopsies of cervical adenocarcinoma. For HPV detection nested polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the L1 gene. For viral typing restriction enzymes (Rsa I, Dde I, Pst I) and DNA sequencing were used. Viral DNA was detected by nested L1 PCR in 100% of biopsies; 38/44 cases could be typed: 81.6% HPV16; 13.2% HPV 18; 2.6% VPH 33 and 2.6% HPV 18/33. Conclusions: The technique was successful in identifying the virus type in 86% of biopsies. There was a strong association ACC-HPV, especially with the viral type 16, detected in 81.6% of established cases.

Key words: HPV, cervical cancer, cervical adenocarcinoma, PCR, RFLP, Sequence.


 

Introducción

En Chile, el cáncer cervico-uterino (CCU) ocupa el cuarto lugar dentro de las neoplasias malignas, con tasas de mortalidad de 8,7 por 100.000 mujeres mayores de 15 años1. En la Región de la Araucanía constituye la tercera causa de muerte por cáncer, con una tasa de mortalidad de 9,4 x 100.0002. La mayoría de los CCU son del tipo escamocelular o epidermoide (80%), mientras que el resto corresponde principalmente al adenocarcinoma cervical (ACC). Desde los años 70, la frecuencia del ACC ha ido en aumento, lo que está en directa relación con la mayor frecuencia de infecciones genitales por el VPH, sumado a otros factores como son el número de parejas sexuales y tiempo de uso de anticonceptivos orales, entre otros3,4.

El VPH se ha establecido, biológica y epidemiológicamente, como el principal agente causal del CCU. A la fecha, alrededor de 18 tipos virales se consideran con potencial oncogénico y se les clasifica como tipos de alto riesgo por su presencia en lesiones de alto grado y en carcinomas5,6. El VPH 16 ha sido el genotipo más frecuentemente detectado a nivel mundial; sin embargo, en países del Asia-Pacífico, el VPH 18 se ha observado en un porcentaje mayor que el VPH 16 en mujeres con ACC4,7,8.

Pese a la prevalencia del CCU en Chile, son escasos los estudios regionales referentes a la distribución de los tipos virales y su asociación con CCU9-12. Nuestro objetivo fue detectar y tipificar el VPH en biopsias de mujeres con ACC, utilizando las metodologías combinadas de RPC y enzimas de restricción (PCR-RFLP) y RPC-secuenciación.

Material y Método

Muestras: Se realizó un estudio retrospectivo analizando 44 biopsias de cuello uterino con diagnóstico histopatológico de adenocarcinoma, utilizando el material que se encontraba disponible en el momento del estudio. Todos los casos fueron obtenidos desde la Unidad de Anatomía Patológica-Citología entre los años 2000 y 2004 en el Policlínico de Patología Cervical del Hospital Hernán Henríquez Aravena. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Servicio de Salud Araucanía Sur.

Extracción de ADN: Manualmente, se microdisecaron 8 cortes de 7 micras de cada caso, de acuerdo al área señalada en la placa teñida con hematoxilina-eosina. El tejido fue digerido en tampón de lisis con proteinasa K (1 mg/ml), se precipitó el ADN con isopropanol y finalmente fue hidratado y guardado a -20º C hasta su análisis. Para evaluar la calidad del ADN todas las muestras fueron sometidas a una RPC simple para el gen de la β-globina13.

Detección VPH. Para la detección se utilizó una RPC anidada, con partidores de consenso dirigidos a una secuencia altamente conservada del gen viral L1 (RPCL1). Los partidores externos (MY11/ MY09) amplifican un fragmento de 450pb ("outer") y los internos (GP5+/ GP6+), un fragmento de 150pb ("inner"). Esta RPCL1 anidada permite detectar tipos virales de alto riesgo (AR) y bajo riesgo (BR), como asimismo subtipos virales aún no caracterizados14. Como controles positivos se utilizaron plásmidos recombinantes para los tipos VPH 6, 11, 16, 18, 31, 35, 33 y 52 (ATTC USA).

Tipificación de VPH. Para la tipificación de los tipos virales se utilizaron dos estrategias. En la metodología A se utilizaron los partidores externos para amplificar el fragmento de 450pb, seguido de RFLP. Se confeccionaron patrones de restricción para los tipos virales más frecuentes de BR y AR ( HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73 y 82), a partir del análisis de las secuencias publicadas en GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy). Aquellas muestras que presentaron una banda visible y clara del fragmento de 450pb, fueron sometidas a digestión (10 µl del producto RPC) con las endonucleasas Rsa I, Dde I y Pst I (Promega USA) que producen un patrón de digestión, exclusivo para cada tipo viral. Las condiciones de RPC (RPCL1"outer") fueron 35 ciclos con temperatura de hibridación de 40 ºC. Los productos RPC se visualizaron en geles de agarosa al 2% y los fragmentos de la digestión enzimática en geles de poliacrilamida al 10%, ambos teñidos con bromuro de etidio.

Aquellas muestras que no pudieron ser tipificadas mediante RPC-RFLP se analizaron aplicando la metodología B, la cual combinó la RPCL1 anidada y secuenciación del fragmento de 150 pb. Las condiciones de RPC (RP-CL1 anidada) fueron 30 y 40 ciclos con temperatura de hibridación de 40 y 45 ºC (para reacción outer e inner, respectivamente). Los productos RPC se visualizaron en geles de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio, se purificaron con E.Z.N.A. Gel Extraction Kit (Omega Bio-tek) y se enviaron a secuenciar (ambas hebras) a Macrogen- Korea. Los resultados fueron analizados con el programa Geneious, que permite comparar las secuencias en estudio con secuencias virales publicadas en Genebank.

Resultados

El grupo de mujeres tuvo un rango de edad entre 24 y 78 años. Con respecto al grado de diferenciación de los ACC, 21 casos eran bien diferenciado, 16 tenían diferenciación moderada y 7 correspondieron a tumores poco diferenciados.

Detección de VPH. En 44 muestras se obtuvo amplificación del gen de la β-globina y todas ellas amplificaron con la RPCL1 anidada, indicando que 100% de las muestras fueron positivas para el VPH (Figura 1).


Tipificación de VPH. Los resultados se pueden observar en la Tabla 1 y en las Figuras 1, 2 y 3. Empleando la metodología A (RPCL1 fragmento "outer" (450 bp) y RFLP), el VPH pudo ser tipificado en un total de 25/44 casos: 22/25 VPH 16; 1/25 VPH 18; 1/25 VPH 33 y un caso con doble infección (VPH 18/33) (Figura 2). Con la metodología B (RPC L1 anidada y secuenciación del producto de RPC de 150 pb) el tipo viral fue identificado en 13/19 casos: 9/13 VPH 16 y 4/13 VPH 18. En 4 muestras el resultado de la secuencia no permitió determinar el tipo viral (muestras no tipificables) y 2 muestras no fueron secuenciadas por no obtenerse la cantidad mínima de producto RPC requerido para secuenciación (Figura 3).





Figura 3. RPCL1 anidada-secuenciación. Se muestra el cromatograma de una secuencia representativa.

En total, combinando ambas metodologías, se tipificaron 38 casos, siendo VPH 16 el genotipo más frecuente dentro de las muestras tipificadas (81,5%), seguido del VPH 18 con 13,1% (en infecciones únicas). De los 5 casos VPH 18 encontrados, 4 correspondieron a mujeres menores de 50 años.

Discusión

La asociación ACC-VPH fue evidenciada en la totalidad de los casos evaluados, lográndose tipificar 86% (38/44) de ellos, utilizando una estrategia metodológica que combinó el uso de dos técnicas basadas en RPC. Al respecto, la aplicación de la metodología A permitió tipificar 25/44 muestras. La principal limitante de este método está en relación a la calidad del material de archivo utilizado, con tiempos de fijación en formalina no estandarizados. La literatura señala que la fijación y el tiempo de almacenamiento de las muestras pueden degradar o fragmentar el ADN, lo cual interfiere con la amplificación de fragmentos mayores a 250 pb, disminuyendo la eficiencia de la RPC15-17. Para analizar muestras de estas características, es recomendable el uso de una RPC anidada que aumenta la sensibilidad de amplificación. Para detectar VPH, Zehbe y cols18, señalan que el uso combinado de los iniciadores MY09/MY11 más los iniciadores GP5+/GP6+, en una RPC anidada, aumenta en 100 veces la sensibilidad de una RPC simple. Esto queda de manifiesto con los resultados obtenidos, puesto que mediante la RPC anidada fue amplificado el ADN viral en todas las muestras positivas para β-globina. Sin embargo, cuando se requirió amplificar solamente el fragmento de 450pb (RPCL1), en 19 muestras, la cantidad de producto de RPC generado fue insuficiente para visualizar bandas post-digestión enzimática. Estos casos fueron analizados mediante la metodología B, la cual se basó en la secuenciación del producto de la RPC anidada, un fragmento más pequeño (150 pb) y visiblemente más abundante que el fragmento de 450 pb, siendo insuficiente para secuenciación (< 10 ng de producto purificado) en sólo 2 muestras. El análisis de las secuencias fue exitoso para 13 casos, pero no permitió identificar el genotipo viral de 4 muestras, ya que ellas mostraron varios patrones de secuenciación que podrían corresponder a infecciones múltiples. Este último hecho limita el uso de esta técnica, ya que permite tipificar muestras que presenten un solo tipo viral. Pese a las limitantes inherentes a ambas técnicas (RPC-RFLP y RPC-secuencia), la combinación de ellas permitió tipificar 86% de los casos estudiados.

Con respecto a los genotipos virales identificados en los ACC, predominó ampliamente VPH 16 (81%), presentándose en un porcentaje significativamente menor VPH 18 (13%). Estos resultados concuerdan con reportes previos, donde los tipos virales más comunes en la gran mayoría de los ACC son VPH 16 y VPH 184,8.

Sin embargo, la revisión de la literatura disponible indica que existe variación en la frecuencia de estos tipos dependiendo de las regiones geográficas, hecho que también ha sido observado en la asociación entre VPH y carcinoma escamoso19,20. Al respecto, Pirog y cols, obtuvieron en mujeres con ACC de Nueva York frecuencias de 50 y 40% para VPH 16 y 18, respectivamente8. Por otra parte, en la población finlandesa se ha reportado una menor frecuencia de VPH 16 (17%) versus VPH 18 (56%)21. Similarmente, el grupo de Andersson y cols, detectó un mayor porcentaje de VPH 18 (52%) seguido del VPH 16 (35%), en biopsias de ACC de mujeres suecas, siendo la presencia de VPH significativamente más frecuente en mujeres menores de 40 años22. También en mujeres japonesas existe una mayor asociación entre adenocarcinoma y VPH 18, aunque las diferencias con respecto al VPH 16 no parecen ser significativas23.

Las variaciones geográficas juegan un papel importante en el predominio de uno u otro tipo de VPH, con ejemplos representativos como son la alta frecuencia de VPH 16 en casos de ACC en la India24 o de VPH 18 en Finlandia22. En Chile y en la Región de La Araucanía, estudios realizados en muestras de adenocarcinoma, VPH 16 fue altamente predominante por sobre los otros tipos virales, existiendo una baja frecuencia de VHP 1825,26. Resultados similares se han observado en otras series de casos latinoamericanos donde la frecuencia de VPH 16 fue de 82,6% y 13% para VPH 1827. Roa y cols, en un estudio multicéntrico encontraron 22% de VPH 18 y Brebi y cols, observaron una frecuencia de 19,5%, siendo las series estudiadas de 35 y 29 casos respectivamente. En estos estudios, el porcentaje de VPH 18 se determinó considerando infecciones únicas y múltiples. En el presente trabajo la frecuencia de VPH 18 sería de 16% si se considera el caso de infección múltiple. Estas diferencias obtenidas se pueden explicar por las metodologías utilizadas. Por un lado, la metodología RPC-RLB (Reverse Line Blot) es más sensible para detectar infecciones múltiples y éstas contribuyen a elevar el número de casos si son incluidas al calcular la frecuencia. De esta manera, en el trabajo de Brebi y cols, podemos observar que la frecuencia de VPH 18 en infecciones únicas sería 13,8%, siendo similar a lo reportado en el presente estudio25,26.

Así, los resultados publicados y los obtenidos en esta investigación, reafirman que en la región de La Araucanía, VPH 16 predomina ampliamente sobre el VPH 18.

Conocer la distribución y frecuencia de los diferentes tipos virales del VPH en adenocarcinoma cervical, contribuirán en el futuro a diseñar y aplicar mejores programas de tamizaje y vacunación en poblaciones de alto riesgo.

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Correspondencia a: Juan Carlos Roa S jcroa@ufro.cl

Financiado parcialmente por el Proyecto DIUFRO-07003 de la Universidad de La Frontera y Proyecto CORFO INNOVA-CHILE nº 07CN13PBT-222.

Recibido: 5 de marzo de 2009 Aceptado: 28 de abril de 2010.

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