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Revista chilena de infectología

versão impressa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. vol.30 no.1 Santiago fev. 2013

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182013000100003 

Rev Chilena Infectol 2013; 30 (1): 17-22

MICROBIOLOGÍA

 

Detección de genes de virulencia en cepas de Enterococcus faecalis susceptibles y resistentes a aminoglucósidos

Detection of virulence genes in aminoglycoside susceptible and resistant Enterococcus faecalis

 

Juan Silva, Yara Rodríguez, Jorge Araya, Joselyne Gahona, Nicomedes Valenzuela, Katheryne Guerrero, John Báez, Fernando Baquero y Rosa del Campo

Universidad de Antofagasta, Antofagasta, Chile. Departamento de Tecnología Médica (JSA, YRG, JAR, JGR, NVL, KGO, JBV).
Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid, España Servicio de Microbiología (FB, RDC).

Correspondencia a:


Background: Enterococcus spp. is an important cause of nosocomial infections A number of virulence factors that may enhance its ability to colonize have been described. Enterococcus is capable of acquiring resistance genes, including high-level resistance (HLR) to aminoglycoside antibiotics. Aim: to investigate the prevalence of genes encoding virulence factors in aminoglycosides susceptible and resistant E. faecalis. Materials and Methods: A total of 80 E. faecalis isolates from clinical (n: 52) and poultry samples (n: 28) were included in this study. Bacterial identification was performed by biochemical tests and phenotypificationwas done using the Phene-PlateTM system. Susceptibility to different antimicrobial agents was determined by the agar dilution method. Virulence genes aceI, agg, gelE and efaA were detected by multiplex PCR. Results: All isolates were susceptible to vancomycin and ampicillin. HLR to gentamicin (13.5%) and streptomycin (9.6%) was detected only in clinical isolates. The phenotyping revealed a great diversity of PhP-types, but only one clone with 7 strains of similar characteristics was found. The efaA gen was detected in 100% of the isolates. aceI gene was present in 94.2% and 75%, agg gene in 73.1%, and 67.9%, and gelE gene in 57.5% and 28.6% of the clinical and chicken isolates, respectively. Only 6 strains with HLR to aminoglycosides, belonging to the same phenotype, had the aceI, agg, gelE and efaA genes. Conclusions: E. faecalis with virulence genes and HLR to aminoglycosides were isolated from clinical and chicken samples in Antofagasta. More studies will be necessary to establish an association.

Key words: High levels of resistance, virulence genes, antibiotics, aminoglycosides, Enterococcus.


Resumen

Antecedentes: Enterococcus spp. es una causa importante de infecciones nosocomiales, tanto en Chile como internacional. Se han descrito una serie de factores de virulencia en este microorganismo, que pueden, por ejemplo, aumentar su habilidad para colonizar. Enterococcus tiene capacidad de adquirir genes de resistencia, entre ellos la resistencia de alto nivel (RAN) a los antimicrobianos aminoglucósidos. Objetivo: Investigar la prevalencia de genes de virulencia en cepas de E. faecalis susceptibles y resistentes a aminoglucósidos. Material y Métodos: Un total de 80 cepas de E. faecalis aisladas de muestras clínicas (n: 52) y pollos (n: 28) se incluyeron en este estudio. La identificación se hizo por pruebas bioquímicas y se tipificaron por el sistema Phene-PlateMR. La susceptibilidad a diferentes antimicrobianos fue realizada por test de dilución en agar. Los genes de virulencia aceI, agg, gelE y efaA fueron investigados por RPC múltiple. Resultados: Todas las cepas de E. faecalis fueron susceptibles a vancomicina y ampicilina. Un 13,5% de las cepas clínicas presentaron resistencia de alto nivel a gentamicina y 9,6% a estreptomicina. La tipificación reveló una gran diversidad de fenotipos, pero se encontró un clon con 7 cepas de características similares. El gen efaA estaba presente en 100% de las cepas, gen aceI en 94,2 y 75%, gen agg 73,1 y 67,9% y gen gelE 57,5 y 28,6% de las cepas clínicas y de pollos, respectivamente. Seis cepas con resistencia de alto nivel a aminoglucósidos, que pertenecían a un mismo fenotipo exhibieron los genes efaA, aceI, agg y gelE juntos. Conclusiones: Cepas de E. faecalis que albergan genes de virulencia y con resistencia de alto nivel a aminoglucósidos fueron aisladas de muestras clínicas y de pollos en Antofagasta. Se requieren mayores estudios para establecer una asociación entre estos factores.

Palabras clave: Resistencia de alto nivel a aminoglucósidos, genes de virulencia, antimicrobianos, Enterococcus.


Introducción

El género Enterococcus forma parte de la microbio-ta gastrointestinal del hombre y de los animales. Durante mucho tiempo no fueron considerados como patógenos primarios. Sin embargo, cepas de Enterococcus spp resistentes a vancomicina (ERV) han emergido como una causa importante de infecciones nosocomiales en todo el mundo12. Este incremento como agente de infecciones nosocomiales se debe, en parte, a su capacidad de adquirir resistencia a los antimicrobianos, lo que hace difícil el tratamiento y también, a su capacidad de adaptarse fácilmente a los cambios del medio. En Estados Unidos de América se aíslan cepas ERV en 25% de las infecciones nosocomiales en las Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) y están considerados como uno de los tres patógenos más comúnmente aislados en las infecciones nosocomiales3.

Enterococcus spp representan un gran desafío terapéutico debido a su resistencia intrínseca a varios antimicrobianos. Ampicilina y vancomicina son los antimicrobianos usados normalmente en el tratamiento de las infecciones producidas por este agente4. Además de la resistencia intrínseca, poseen capacidad de adquirir genes de resistencia y de virulencia, que son transferidos por plasmidios o transposones conjugativos. Una gran importancia ha sido reconocida para las cepas de Ente-rococcus que adquieren resistencia de alto nivel (RAN) a aminoglucósidos5,6.

A pesar de su patogenicidad relativa, varios factores de virulencia han sido descritos en este género, codificados en genes de virulencia, mayormente en cepas de Enterococcus faecalis7. Entre ellos, destacan el antígeno A (efaA), la sustancia de agregación (asaI o agg), gelatinasa (gelE), proteína enterocócica de superficie (esp), citolisina (cylA), adhesina del colágeno (aceI) y hialuronidasa (hyl)7-13.

El gen asaI o agg, albergado en un plasmidio, codifica para la producción de una sustancia de agregación (feromona inducible) que participa en la conjugación de enterococos7. La sustancia de agregación aumenta la adherencia a las células de los túbulos renales, a las células intestinales y finalmente, se ha asociado a endocarditis en modelos animales8.

El gen cromosomal gelE codifica para una gelatinasa, que es una metalopeptidasa extracelular que hidroliza colágeno, gelatina, caseína, hemoglobina y pequeños péptidos y se ha visto que produce exacerbación de la endocarditis en modelos animales9.

El gen aceI codifica para una adhesina que es capaz de interactuar con el colágeno tipo I y IV y la laminina, favoreciendo la unión de enterococos a las células del hospedero13.

En estudios anteriores, hemos aislados cepas de E. faecalis de origen clínico y ambiental, las cuales presentaban ausencia de resistencia a vancomicina, pero exhibían resistencia de alto nivel a aminoglucósidos14,15. Este trabajo tiene como objetivo estudiar la presencia de genes de virulencia en diferentes fenotipos bioquímicos de E. faecalis susceptibles y resistentes a aminoglucósidos.

Material y Métodos

Cepas bacterianas

Se incluyeron 80 cepas de E. faecalis, 52 aisladas de muestras clínicas en el Hospital Regional de Antofagasta: orina (n: 29), herida operatoria (n: 8), sangre (n: 1), secreción vaginal (n: 10), otras muestras clínicas (n: 4); y cepas provenientes de pollos expendidos en locales comerciales (n: 28), todas recolectadas en el año 2008. Las cepas fueron identificadas mediante pruebas bioquímicas con diferentes sustratos, de acuerdo a lo descrito por Manero y Blanch16 También, se identificaron por medio de la comparación de los resultados del Phene-PlateR con datos de cepas referenciales del patrón de PhP del Programa PhPWiM417.

Susceptibilidad in vitro a antimicrobianos

Se evaluó la concentración inhibitoria mínima (CIM) de las cepas de E. faecalis por técnica de dilución en placa, de acuerdo a los criterios establecidos por el CLSI18. Se incluyeron los siguientes antimicrobianos: amikacina (AMK), ampicilina (AMP), penicilina (P), vancomicina (V), gentamicina (G), ciprofloxacina (CIP), tetraciclina (T), eritromicina (E), estreptomicina (SM) y cloranfenicol (CAF). Los resultados fueron expresados como la CIM50 y CIM90, y se determinaron los porcentajes de resistencia. Además, se determinó la resistencia de alto nivel (RAN) a aminoglucósidos, los que correspondieron a > 500 μg/ml para G y > 2.000 μg/ml para SM. En todos los ensayos, se incluyó la cepa de E. faecalis ATCC 29212, como control.

Tipificación de fenotipos bioquímicos

La determinación de los fenotipos bioquímicos (biochemical fingerprinting) se realizó por el método de PhP-RF (Phene-Plate Techniques AB, Sweden), de acuerdo a recomendaciones descritas en trabajos anteriores14. A partir de una colonia de Enterococcus sp cultivada en placa de agar sangre se sembró un tubo con 10 ml de proteosa peptona (Difco) 0,1%, conteniendo azul de bromotimol 0,01% y se inocularon alícuotas de 150 μl a los pocillos de microplacas que contenían 8 sets con 11 sustratos deshidratados seleccionados para identificar los fenotipos bioquímicos de Enterococcus spp. Las microplacas se incubaron a 37°C hasta un total de 64 h. La cinética de las reacciones fue evaluada midiendo los valores de absorbancia a las 16, 40 y 64 h. El fenotipo bioquímico (fingerprinting) se calculó como el valor promedio para cada reactivo de las tres lecturas, mediante el programa computacional PhP-WiM4. Las similitudes entre las cepas ensayadas fueron calculadas como coeficientes de correlación (r) y fueron reunidas de acuerdo al método de grupo par no pesados con promedios aritméticos (UPGMA)17. Los fenotipos bioquímicos que se encontraron en más de una cepa fueron llamados fenotipos comunes (PhP-C), y aquellos que presentaron solamente un aislado fueron llamados fenotipos solos (PhP-S).

Detección de genes de virulencia

La amplificación de los genes de virulencia se realizó por técnica de RPC múltiple de los genes aceI, gelE, agg y efaA7. Los partidores utilizados fueron descritos previamente7,13. La secuencia de los partidores y tamaño esperado de los amplicones para cada ensayo de RPC se muestran en la Tabla 1. En los ensayos se incluyó, además, una cepa de E. raffinosus y una de E. gallinarum como controles negativos. Las cepas de Enterococcus se sembraron en agar sangre a 37°C por 18-24 h. Se tomaron varias colonias y se hizo una emulsión espesa en microtubos que contenían 200 μl de agua destilada estéril, que se pusieron a ebullición (100 °C) durante 10 min, luego se centrifugó a 12.000 rpm por 5 min. Se tomaron 2 μl del sobrenadante y se agregó a la mezcla de reacción, en un volumen final de 25 μl, conteniendo: 1 μl MgCl2 50 mM, 2,5 μl tampón RPC, 1 μl dNTPs 10 mM, 1 ml de cada partidor 100 pmol, 1 U Taq polimerasa (promega) y 13,5 μl agua milliQ ultrapura. El primero de los sets contenía los partidores de los genes aceI y agg y el segundo set efaA y gelE. La amplificación de la mezcla se hizo en un equipo de RPC (PTC-100 Programable Termal Controller, MJ Research, Inc., Watertonw, MA), con una denaturación inicial de 95°C por 5 min; seguido de 35 ciclos de 95°C por 30 seg, 56°C por 1 min y 72°C por 2 min; y una extensión final 72°C por 10 min. Después de la amplificación, una muestra de 6 μL de cada reacción fue analizada mediante electroforesis en un gel de agarosa a 1% con bromuro de etidio (Equipo Power Pac Basic, BioRad, USA). Se usó como marcador de tamaño molecular de AlDN un 100-bp DNA ladder (Invitrogen, Merelbeke, Belgium).

Tabla 1. Oligonucleótidos partidores y productos en la detección de los genes de virulencia en cepas de E. faecalis por RPC

Análisis estadístico

La comparación de los datos de las cepas de Enterococcus recuperadas de muestras clínicas y de pollos se hizo mediante el análisis de las variables cualitativas con el test de Fisher, utilizando el Programa Minitab 15. Un valor p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

Los resultados de las pruebas bioquímicas permitieron la identificación de las cepas de E. faecalis y los análisis del Ph-plate confirmaron estos resultados. En la Tabla 2 se muestra la gran susceptibilidad que exhibieron las cepas de Enterococcus frente a V y AMP, con una CIM50 y CIM90 que fluctuaron entre 0,5 y 4 μg/ml. Se observó resistencia a CAF, 90,9 y 39,3% (p < 0,05); T 57,6 y 35,7% (p > 0,05); E 32,7 y 14,3% (p > 0,05) de las cepas clínicas y de pollo, respectivamente. Un 30% de las cepas clínicas exhibió resistencia a CIP (p < 0,05). En general, las cepas clínicas fueron más resistentes a los antimicrobianos, pero en algunos casos esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Las diferencias entre las cepas de Enterococcus aisladas de muestras clínicas y de pollos con RAN a G 13,5/3,6% (p 0,250), RAN a AMK 11,5/3,6% (p 0,412), y RAN a SM 9,6/0% (p 0,156), no son estadísticamente significativas.

Tabla 2. Distribución de la CIM50 y CIM90 de cepas de E. faecalis a antimicrobianos

El sistema Phene-Plate permitió la identificación de 16 fenotipos bioquímicos diferentes que no presentaron correlación alguna con el origen de aislado, solamente el PhP-tipo C3 fue el más frecuentemente aislado en las cepas clínicas (7 cepas) y el PhP-tipo C2 en las de pollo.

Los resultados de la RPC múltiple mostraron que los amplicones obtenidos correspondieron a los tamaños moleculares para cada uno de los genes de virulencia ensayados. En la Figura 1, la electroforesis muestra una banda que corresponde al gen efaA (705 pb) presente en todas las cepas de E. faecalis y ausente en E. raffinosus y E. gallinarum. También se aprecia otra banda de 419 bp correspondiente al gelE presente en varias cepas de E. faecalis. En la Figura 2, las bandas corresponden a los genes agg (1.553 pb) que se encontraba presente en varias cepas de E. faecalis y también se aprecia una banda de 1.003 bp, correspondiente al gen aceI que se detectó en algunas de las cepas ensayadas.

Figura 1. Línea 1 y 28 marcador de tamaño molecular (100 bp). Líneas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23 cepas clínicas E. faecalis y líneas 24, 25, 26 y 27 cepas de E. faecalis de pollos fueron positivas para el gen efaA. Línea 10 E. raffinosus y línea 13 E. gallinarum fueron negativas para el gen efaA. Las bandas inferiores corresponden al gen gelE, el cual detectó en las líneas 4, 8, 14, 15, 18, 19, 20 y 23 de las cepas clínicas de E. faecalis y línea 25 y 26 de las cepas de pollos.

Figura 2. Línea 1 y 28 marcador de tamaño molecular (100 bp). Líneas 2, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 1 5, 18, 19, 20, 21, 22 y 23 cepas clínicas E. faecalis y líneas 24, 25 y 26 de cepas de E. faecalis de pollos fueron positivas para el gen agg. Línea 1 0 E. raffinosus y línea 1 3 E. gallinarum fueron negativas para el gen agg. Las bandas inferiores corresponden al gen acel, el cual detectó en las líneas 3, 4, 5, 7, 12, 14, 1 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23 de las cepas clínicas de E. faecalis y línea 24, 25 y 26 de las cepas de pollos.

En la Figura 3, se muestran los porcentajes de los genes de virulencia encontrados en las distintas cepas de Enterococcus. Estos revelan que el gen efaA, que codifica para un antígeno de superficie, estaba presente en 100% de cepas de E. faecalis, tanto en las de origen clínico como en las aisladas de pollos. El gen efaA no se detectó en las cepas de E. raffinosus y E. gallinarum. El gen aceI (adhesina), estaba presente en 94,2% de las cepas clínicas y en 75% de las provenientes de pollos (p 0,028). El gen que codifica para la sustancia de agregación (agg) fue encontrado en 73,1% de las cepas clínicas y 67,9% en las obtenidas de pollos (p 0,616). Finalmente, el gen gelE fue encontrado en menor proporción con 57,7% en las cepas clínicas y 28,6% en las aisladas de pollos (p 0,019). En general se aprecia que los genes de virulencia están presentes en mayor proporción en las cepas de E. faecalis que fueron aisladas de muestras clínicas, pero esta diferencia es estadísticamente significativa sólo para los genes aceI y gelE.

Figura 3. Porcentajes de los genes de virulencia presentes en cepas de Enterococcus faecalis aisladas de muestras clínicas y provenientes de pollos. Antofagasta, Chile.

En la Tabla 3, se presenta la combinación de los genes aceI, gelE, agg y efaA presentes en las cepas de E. faecalis. Se encontró que los cuatro genes estaban presentes en 57,7% de las cepas clínicas y en menor proporción en las recuperadas de pollos, alcanzando a 17,9% (p < 0,05). Las otras combinaciones de tres y dos genes de virulencia juntos, se encontraron en porcentajes variables en los aislados clínicos y procedentes de pollos.

Tabla 3. Combinaciones de los genes aceI, gelE, agg y efaA presentes en cepas de Enterococcus faecalis de origen clínico y avícola aisladas en Antofagasta, Chile

En la Tabla 4, se exhiben los resultados de los análisis de RPC que mostraron la presencia de genes de virulencia en la mayoría de las cepas de E. faecalis, los que se encontraron en mayor proporción en las cepas resistentes a altos niveles de aminoglucósidos.

Discusión

En los últimos años, E. faecalis resistente a antimicrobianos ha emergido como un importante patógeno nosocomial y también de infecciones adquiridas en la comunidad, cuya evolución y diseminación de resistencia ha sido facilitada por el uso de antimicrobianos a nivel hospitalario y en la comunidad, como así también, por el uso como aditivo de la alimentación en la crianza de animales19. En Chile, los reservorios y fuentes de E. faecalis resistentes a antimicrobianos no han sido completamente definidos e investigados, como así también, los mecanismos que ponen en juego para evadir la acción de los antimicrobianos y de sus capacidades de producir daño.

En relación a la resistencia a antimicrobianos, destaca la ausencia de resistencia a V, hallazgo similar a lo descrito en otros trabajos15. Esta situación puede deberse al uso restringido de V y por otro lado, su uso en el Hospital Regional de Antofagasta está orientado al tratamiento de los pacientes con condiciones de gravedad. Sin embargo, hoy día el aislamiento de ERV va en aumento en todo el país20-23.

En años recientes, se ha detectado un aumento de la prevalencia de resistencia a T, como así también a CIP23. En nuestro estudio, más de 58% de las cepas de E. faecalis presentaban resistencia a T. Frente a CIP se encontró una resistencia de 30,8%, fenómeno presente sólo en cepas de origen clínico.

La RAN a G se encontró en 13,5%, a AMK 11,5% y a SM en 9,6% de las cepas de origen clínico. Si bien estos resultados no son elevados, ya son una realidad en nuestro medio. Respecto a esto, en una publicación anterior se encontró 10% de cepas de Enterococcus spp con RAN a G en los aislados de cinco hospitales del norte de Chile15. Estos resultados señalan la posible presencia de enzimas modificantes de aminoglucósidos en estas cepas, especialmente la enzima bifuncional que codifica el gen aac6-aph2" y que ha sido descrita en E. faecalis24,25. El aislamiento de cepas de Enterococcus con RAN a G podría ir en aumento en los hospitales del norte de Chile, lo que constituiría un serio problema, pues disminuye la posibilidad de su asociación con β-lactámicos o V para obtener un efecto sinérgico y tratar en mejor forma las infecciones graves4,5.

Los resultados de la tipificación de las cepas de Enterococcus por el sistema Ph-Plate, nos mostraron la existencia una gran diversidad de fenotipos, tanto en las cepas clínicas como en las aisladas de pollo. Sin embargo, se encontraron algunos fenotipos bioquímicos predominantes en ambos tipos de aislados, lo que sugiere que existe una diseminación de estos clones en el medio hospitalario y también en las aves.

En este estudio se determinó la presencia de cuatro genes de virulencia; aceI, gelE, agg y efaA en cepas de E. faecalis. En ambos tipos de aislados (humanos y pollos) fue demostrada la presencia de estos genes, ya fuese en forma aislada o en combinaciones. El gen efaA fue encontrado en la totalidad de las cepas de E. faecalis y no se detectó en otras especies de Enterococcus, lo que parece indicar que este gen podría ser un marcador específico de E. faecalis.

Los determinantes de virulencia fueron encontrados en mayor proporción en las cepas clínicas que en las aisladas en pollos, lo que concuerda con otros trabajos26. Sin embargo, sólo se observó significancia estadística en la presencia de los genes aceI y gelE. Los hallazgos de nuestro estudio señalan que 57,7% de las cepas de E. faecalis aisladas en hospitales albergaban los genes aceI-gelE-agg-efaA juntos y también, que en estas cepas clínicas, incluían algunos fenotipos bioquímicos predominantes, con RAN a aminoglucósidos, lo que ha sido descrito también en trabajos similares27.

Por otro lado, una amplia variedad de genes de virulencia han sido detectados en E. faecalis aislados de fecas de pollos y no en otras especies de Enterococcus28, lo que concuerda con nuestro trabajo. Es importante señalar que estas cepas de E. faecalis aisladas en pollos, que albergan genes de virulencia, pueden también constituirse en una fuente de transmisión al ser humano.

Se concluye que clones de E. faecalis con RAN a aminoglucósidos se han aislados de muestras clínicas y de pollos en el norte de Chile y que en algunos de ellos, se encontraron presentes genes de virulencia. Sin embargo, es necesario realizar nuevos estudios con un mayor número de cepas de Enterococcus para establecer si este tipo de resistencia está asociado a los factores de virulencia.

 

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Los autores declaran no tener conflicto de intereses

Financiado por Proyecto PROIM N° 1357, Dirección de Investigación de la Universidad de Antofagasta y Proyecto N° 4549 Minera Escondida, Antofagasta, Chile.

Recibido: 28 de marzo de 2012 Aceptado: 9 de diciembre de 2012

Correspondencia a: Juan Silva Avalos jsilva@uantof.cl

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