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Revista chilena de infectología

versión impresa ISSN 0716-1018

Rev. chil. infectol. vol.33 no.4 Santiago ago. 2016

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-10182016000400009 

Artículo Original / Patogenia

 

Mecanismos de virulencia de Escherichia coli enteropatógena

Virulence mechanisms of enteropathogenic Escherichia coli

 

Ana Elvira Farfán-García, Sandra Catherine Ariza-Rojas, Fabiola Andrea Vargas-Cárdenas y Lizeth Viviana Vargas-Remolina

Universidad de Santander-UDES, Bucaramanga, Santander, Colombia.

Facultad de Ciencias de la Salud. Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Correspondencia a:


Acute diarrheal disease (ADD) is a global public health problem, especially in developing countries and is one of the causes of mortality in children under five. ADD etiologic agents include viruses, bacteria and parasites in that order. Escherichia coli bacteria it is classified as a major diarrheagenic agent and transmitted by consuming contaminated water or undercooked foods. This review compiled updates on information virulence factors and pathogenic mechanisms involved in adhesion and colonization of seven pathotypes of E. coli called enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), shigatoxigenic E. coli (STEC), enteroaggregative E. coli (EAEC) and diffusely-adherent E. coli (DAEC). A final pathotype, adherent-invasive E. coli (AIEC) associated with Crohn's disease was also reviewed. The diarrheagenic pathotypes of E. coli affect different population groups and knowledge of the molecular mechanisms involved in the interaction with the human is important to guide research towards the development of vaccines and new tools for diagnosis and control.

Key words: Escherichia coli, virulence factors, pathogenicity, diarrhea.


Resumen

La enfermedad diarreica aguda (EDA) es un problema de salud pública mundial, especialmente en los países en vía de desarrollo y es una de las causas de mortalidad en niños bajo cinco años de edad. Los agentes etiológicos de EDA incluyen virus, bacterias y parásitos, en ese orden. Dentro de las bacterias, Escherichia coli está clasificada como uno de los principales agentes diarreagénicos y se trasmite por el consumo de agua y alimentos contaminados o mal cocidos. Esta revisión recopiló información actualizada sobre los factores de virulencia y los mecanismos de patogenicidad implicados en la adhesión y colonización de siete patotipos de E. coli denominados, E. coli enteropatógena (ECEP), E. coli enterotoxigénica (ECET), E. coli enteroinvasora (ECEI), E. coli shigatoxigénica (ECST), E. coli enteroagregativa (ECEA) y E. coli de adherencia difusa (ECAD). Un último patotipo, E. coli adherente invasor (ECAI) asociado a la enfermedad de Crohn también fue revisado. Los patotipos diarreagénicos de E. coli afectan a diferentes grupos poblacionales y el conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la interacción con el humano es importante para orientar las investigaciones hacia el desarrollo de vacunas o nuevas herramientas para su diagnóstico y control.

Palabras clave: Escherichia coli, factores de virulencia, patogenicidad, diarrea.


 

Introducción

En los últimos años, las muertes de niños bajo cinco años de edad han disminuido; no obstante, las cifras aún son alarmantes. Entre las primeras causas de muerte por infecciones se encuentran la neumonía, seguida por diarrea y malaria1-3. Datos obtenidos de análisis sistemáticos, demostraron que entre los años 2010 y 2011 se presentaron entre 7,6 y 6,9 millones de muertes de niños bajo cinco años de edad, respectivamente. El 9,9% de esas muertes fue a causa de la diarrea2. Rotavirus, calicivirus, Escherichia coli enteropatógena y E. coli enterotoxigénica causaron más de la mitad de los casos2,3.

La enfermedad diarreica aguda (EDA) es una problemática que afecta a adultos y niños y E. coli se encuentra entre las principales causas bacterianas de diarrea. Sus patotipos se han relacionado con mayor frecuencia a EDA en niños bajo cinco años de edad4.

Se han descrito seis patotipos de E. coli involucrados en procesos diarreicos, mediante la identificación de factores de virulencia y mecanismos de patogenicidad. E. coli enteropatógena (ECEP), E. coli enterotoxigénica (ECET), E. coli enteroinvasora (ECEI), E. coli shigatoxigénica (ECST), E. coli enteroagregativa (ECEA), E. coli adherente difusa (ECAD)5 y E coli adherente invasora (ECAI)6.

Escherichia coli enteropatógena es el patotipo más asociado a diarrea en lactantes y algunas veces se asocia a vómito y fiebre7. Escherichia coli enteroinvasora es de importancia en niños sobre seis meses de edad, su manifestación general es diarrea y en ocasiones va a acompañada de sangre y moco8. Escherichia coli enterotoxigénica tiene mayor frecuencia en niños bajo dos años, la diarrea puede acompañarse de fiebre y algunas veces vómito y es el principal agente causal de la diarrea acuosa del viajero seguido por ECEA y otras etiologías como Salmonella spp, Shigella spp o Campylobacter jejuni9. Escherichia coli enteroagregativa suele causar diarrea persistente de un color verde característico y con presencia de moco. La diarrea acuosa causada por ECAD se presenta sin sangre, en niños que van desde el año hasta los cinco años de edad8. Y por último, ECST, que causa dolor abdominal, diarrea sanguinolenta y poca fiebre, es el principal agente etiológico asociado al síndrome hemolítico urémico (SHU), caracterizado por daño renal, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia10. En los casos más graves puede causar complicaciones del sistema nervioso central11,12.

Dada la importancia clínica que tiene la enfermedad diarreica en el mundo, la presente revisión recopiló información actual sobre los factores de virulencia de los patotipos de E. coli como uno de los principales agentes diarreagénicos, con el propósito de que esta información proporcione datos de interés en el conocimiento de este patógeno.

Métodos

Para esta revisión se usaron las bases de datos EBS-CO, Science Direct, NCBI y Hinary, usando términos como "Escherichia coli virulence, virulence factors, enteropathogenic, enterohemorrhagic, enteroinvasive, enterotoxigenic, enteroaggregative, diffusely adherent y adherent invasive". Se tomaron en cuenta investigaciones originales y revisiones con artículos completos disponibles, de los cuales se incluyeron en total 143 artículos.

Resultados y Discusión

Escherichia coli enteropatógena

Es el agente causal de diarrea en niños bajo dos años, que causa frecuentemente brotes epidémicos en lugares cerrados como guarderías y hospitales. La enfermedad puede ser moderada a grave y se ha asociado a alta mortalidad (10-40%), principalmente en los países en vías de desarrollo. En el año 2010 se notificaron 121.455 muertes por este patotipo13. El período de incubación es de 3 a 24 h y el cuadro diarreico puede tornarse persistente y acompañarse de fiebre y vómito.

Las cepas de ECEP se dividen en típicas y atípicas, por la presencia (típicas) o ausencia (atípicas) de un plásmido de virulencia llamado factor de adherencia de ECEP (EAF: EPEC adherence factor)14. La caracterización de las cepas atípicas ha cobrado importancia debido a que su aislamiento ha aumentado no sólo en niños asintomáticos sino también en niños con diarrea durante brotes epidémicos de diarrea.

En la infección intestinal por ECEP se producen cambios en la actividad fisiológica normal del enterocito debido al aumento de la secreción de electrolitos por parte de las células hacia el espacio extracelular, al aumento de la permeabilidad de las uniones intra e intercelulares y al cambio estructural, en la forma, de la región apical del enterocito. Éste pierde su capacidad absortiva y los solutos se acumulan en el lumen intestinal, lo que conduce a diarrea acuosa.

Los mecanismos fisiopatológicos que originan el cuadro diarreico se relacionan principalmente con la alteración de la célula intestinal debido a la lesión de adhesión y borrado (A/E: attaching/effacing) y a la formación de pedestales15,16.

Para el primer mecanismo, ocurren tres eventos de forma prácticamente simultánea:

Adherencia inicial al enterocito. La bacteria entra en contacto con la célula mediante un flagelo y el pili tipo IV (BFP: bundle-forming pilus), que tienen como función la auto-agregación bacteriana y la adherencia a la célula mediante la formación de microcolonias17,18. Este pili es codificado por 14 genes, los cuales son regulados por el operon per (plasmid-encoded regulator)19 y por una proteína DsbA que forma enlaces disulfuro para darle estabilidad20. Estos genes se localizan en el plásmido de virulencia EAF21.

• Translocación de señales intracelulares. Ésta es facilitada por el sistema de secreción tipo 3 (T3SS: type III secretion system), mediante el cual diversas proteínas efectoras ingresan al enterocito22,23. Este sistema macromolecular es codificado en la isla de patogenicidad locus de esfacelamiento del enterocito (LEE: locus of enterocyte effacement)24, el cual se divide en cinco operones policistrónicos (LEE1-LEE5). LEE1-LEE3 codifican los genes de las proteínas Esc (Esc: E. coli secretion) que conforman el T3SS18, LEE4 codifica los genes de las proteínas secretoras Esp (en inglés Esp: EPEC-secreted proteins) (EspA, EspB y EspD) y para algunas efectoras (EspF, EspG, EspH, EspZ y Map)25. Finalmente, LEE5 codifica los genes eae para la adhesina bacteriana intimina y tir para el correspondiente Tir (Tir: translocated intimin receptor). La expresión génica de LEE, está regulada por per, Ler (LEE-encoded regulator), GrlA Global regulator of LEE activator) y GrlR (global regulator of LEE repressor)26. Estas proteínas efectoras contribuyen al daño celular mediante la formación de conductos o filamentos (EspA, EscF)27 y poros para la translocación de proteínas en la membrana del enterocito (EspB, EspD)28, cambios del potencial de membrana de la mitocondria (proteína asociada a la mitocondria Map: mitochondria-associated protein), formación transitoria de filopodios mediante la activación de GTPasas29,30, reorganización y pérdida de la nucleolina para bloquear el proceso del ARNr (EspF)31 y la alteración de los microtúbulos en algunas células epiteliales (EspG)32 (Figura 1). Otra proteína efectora muy importante es EspC, secretada por el sistema de secreción tipo V, que está involucrada en la citotoxicidad celular durante la adhesión bacteriana, la formación de pedestales y poros33,34.

 

Figura 1. E. coli enteropatógena. La adherencia de ECEP (EPEC en la figura) está
mediada por un flagelo y por el pili tipo IV (BFP) que también une las bacterias entre
si formando microcolonias, permitiendo que éstas se separen y colonicen. ECEP y
ECST (STEC en la figura) tienen un sistema de secreción (T3SS) que inyecta proteínas
en la célula, dentro de ellas se encuentra EspF que se dirige al nucléolo donde bloquea
el proceso del ARNr. Map que induce la formación de filopodios activando una GTPasa
Cdc 42, aunque sólo es momentáneo porque después EspH interrumpe esta formación
para que otra proteína llamada Tir unida a la intimina (proteína de la membrana externa
de la bacteria) se fosforile en tirosina 474, el cual se une a proteínas adaptadoras
como Nck o CrK. NcK activa a N-WASP que a su vez activa Arp 2/3, mediador de la
polimerización de actina. La unión Tir-Intimina finalmente provoca la reorganización de
la actina, alterando la morfología y formando las lesiones de adhesión y borrado (A/E).

 

• Adherencia íntima bacteriana. De forma simultánea a la unión de T3SS al enterocito y a la entrada de las proteínas efectoras a través de los poros, la bacteria ingresa la proteína Tir (receptor) que facilita la adherencia a la intimina bacteriana y es indispensable para la formación del pedestal y la lesión intestinal35. Una vez dentro de la célula hospedera, la cabeza de Tir se proyecta a la superficie de la membrana del enterocito, donde actúa como receptor para la intimina y para la transmisión de señales después de la interacción36. Esto contribuye al segundo mecanismo de polimerización de la actina y a la formación de pedestales.

En el segundo mecanismo, la polimerización, se forman largas cadenas de actina que alteran la morfología del citoesqueleto, se dañan las microvellosidades y éstas pierden su función37. Para la formación del pedestal, Tir es fosforilada en tirosina 47437. Posteriormente, la tirosina 474 se une a las proteínas adaptadoras de la célula hospedera (Nck: Non-catalytic tyrosine kinase). Nck activa N-WASP (neural Wiskott-Aldrich-syndrome protein) que a su vez activa el complejo Arp 2/3 mediador de la polimerización de actina38. Otra proteína adaptadora es la Crk (CrK: CT10 regulator of kinase) que compite con Nck por la unión a la tirosina 474, con la diferencia que Crk inhibe la polimerización de actina39, aunque no se ha entendido cuál función cumple al regularla negativamente (Figura 1). Este proceso es regulado por EspH y por Tir-intimina de manera independiente40,41. Por último, EspZ bloquea la translocación de proteínas al finalizar la infección o durante ésta. Ésta se une a EspD mediante la inhibición del paso de EspF, Map y Tir41.

Escherichia coli shigatoxigénica

Este patógeno se caracteriza por producir una o más toxinas Shiga (Stx) similares a las producidas por Shigella dysenteriae tipo 1, por lo que se les denomina shigatoxigénicas42. También se han descrito como E. coli enterohemorrágica (EHEC, del inglés enterohemorragic E. coli) y E. coli verotoxigénica (VTEC, del inglés verotoxigenic E. coli) debido a la producción de una toxina con efecto citotóxico sobre las células vero43. ECST es un patógeno de carácter zoonótico de gran importancia en salud pública, que causa dolor abdominal, diarrea sanguinolenta y poca fiebre. Es el principal agente etiológico del síndrome hemolítico urémico SHU10,11, el cual ocurre aproximadamente en 5 y 10% de los casos y produce anemia hemolítica, trombocitopenia y falla renal.

Escherichia coli shigatoxigénica es prevalente en países desarrollados como Estados Unidos de América, Canadá, Australia y en algunos de Europa. En Latinoamérica, es endémica en Argentina con una prevalencia aproximada de 500 casos por año y una incidencia de 12 a 14 casos por cada 100.000 en niños bajo cinco años, presentándose el mayor número de casos de SHU en el mismo grupo etario, con una mortalidad entre 3 y 5%44. Sin embargo, ECST puede afectar a todos los grupos de edad, en los cuales puede provocar enfermedad grave.

Más de 400 serotipos de ECST han sido implicados en los brotes esporádicos humanos que cursan desde enfermedad leve a colitis hemorrágica y SHU en los casos más graves. La colitis hemorrágica está mediada por las toxinas Stx, la que puede progresar a colitis gangrenosa, perforación del intestino, peritonitis o sepsis45. El serotipo O157:H7 es el más importante en clínica.

A continuación se describen sus mecanismos de patogenicidad más importantes:

• Adherencia de ECST: La interacción de ECST con los enterocitos está mediada por la intimina y el T3SS, descritos en ECEP. La unión de la intimina con su receptor Tir y a la nucleolina46, contribuye en la fijación inicial de ECST a la célula, lo que produce lesiones A/E características de este patotipo (Figura 1)47. Al igual que en ECEP, los factores que participan en la formación de la lesión se codifican en la isla de patogenicidad LEE24.

• Toxina Stx: Ésta tiene los subgrupos Stx1 y Stx2 inmunológicamente diferentes y cada cepa puede presentar uno o ambos. Stx2 está más asociado a los casos de SHU48,49 y está compuesta por las subunidades A y B (Figura 2a). El ingreso a la célula y la distribución de la toxina hacia diferentes órganos son mediados por tres mecanismos principales: a) Macropinocitosis (MPC): permite la entrada de Stx cuando el receptor de las membranas globotriaosilceramida 3 (Gb3) no es expresado por la célula, como en el caso de los enterocitos. La MPC ocurre independientemente de T3SS y de la intimina, es decir, es estimulada por la reorganización de la actina mediante la proteína P secretada por E. coli (EspP: E. coli secreted protein P)50,51, que contribuye a la formación de microcolonias y a la adhesión a células epiteliales de colon T8451 (Figura 2b); b) Transcitosis: mediante vesículas la toxina pasa de un espacio extracelular a otro (Figura 2b)52. Este mecanismo aún está en estudio; no obstante, se conoce que aumenta debido a la MPC y facilita la propagación sistémica de la toxina hacia las células endoteliales que expresan Gb3, siendo el endotelio glomerular el que expresa los mayores niveles10. Le siguen en su orden las células endoteliales del intestino y cerebro50,52,53; c) Endocitosis: una vez se une la subunidad B de la toxina al receptor Gb3 y posteriormente, mediante invaginación de la membrana celular, la toxina es introducida al citoplasma54. Adicionalmente, el fragmento A1 de la subunidad A, realiza actividad enzimática sobre el ARNr 28S, inhibe la síntesis proteica y conduce a la muerte celular55 (Figura 2c).

 

Figura 2. E. coli shigatoxigénica. a. La toxina Shiga (Stx) está compuesta por una
subunidad A que tiene dos fragmentos: A1 con actividad enzimática y A2 que se une
a la subunidad B, pentámero encargado de la unión al receptor Gb3 en la célula
hospedera; b. Existen factores como EspP que estimulan la reorganización de actina
en ausencia de receptores Gb3, que permiten la entrada de Stx al enterocito por
medio de macropinocitosis (MPC) y se desplaza dentro de la célula por transcitosis
para llegar a la circulación; c. Sxt viaja hasta encontrar el receptor Gb3 que se une
a la subunidad B de la toxina y permite la entrada a las células endoteliales por
endocitosis, donde la subunidad A1 se dirige al ARNr para bloquear la síntesis de
proteínas y producir la muerte celular.

 

Otros factores de virulencia de ECST: Adicionalmente, el plásmido pO157 de ECST codifica genes para catalasa-peroxidasa (katP)56, adhesina ToxB57, metaloproteasa dependiente de zinc (StcE)58-61 y para la enterohemolisina (Ehx)59, cuyas funciones están principalmente enfocadas a mediar la unión a la célula hospedera, degradación de mucinas y glicoproteínas, regular mecanismos de inflamación y citotoxicidad, entre otras56-63.

Escherichia coli enterotoxigénica

Es uno de los agentes más frecuentemente identificados en diarrea aguda. Aproximadamente, cada año se presentan 280 millones de infecciones por ECET en niños bajo 4 años, de los cuales entre 300.000 a 500.000 mueren y se cree que más de 40 millones son asintomáticos64. Se conoce como diarrea del viajero y tiene amplia distribución en países en vías de desarrollo. Sin embargo, es frecuente aislarla de personas asintomáticas. En algunos casos la diarrea por ECET puede ser leve, sin presencia de moco o sangre; en otros casos puede ser profusa causando deshidratación grave. Algunos casos presentan cefalea y vómito3,5,9.

Cada cepa tiene estructuras en su superficie, necesarias para la adhesión, denominados factores de colonización (CFs: colonization factors) y que en ECET son llamados antígenos de superficie coli (CSs: Coli surface antigens), antígenos de los factores de colonización (CFAs: colonization factor antigens) o PCFs (putative colonization factors). De estas estructuras fimbriales, afimbriales, helicoidales o fibrilares, hasta la fecha se conocen aproximadamente 25, en su mayoría codificados en plásmidos de virulencia9,65-67. Las toxinas y los perfiles de adhesinas son variables entre poblaciones y regiones geográficas.

En ECET son dos los principales mecanismos de patogenicidad: adherencia y toxinas.

Adherencia: Los CFs se encargan de la adhesión de las bacterias a receptores (fibronectina, glicoesfingolípidos y glicoproteínas) de las células epiteliales del intestino delgado, lo que permite su colonización65-67. Algunos de estos CFs se han asociado a movilidad y auto-agregación bacteriana67,68. Aproximadamente, en 50% de las cepas de ECET no se logran identificar los CFs66. Para la adherencia de ECET a las células epiteliales, la bacteria expresa la EtpA, exoproteína de adhesión (TPS: two-partner secretion) situada al extremo del flagelo, para permitir que los CFs se adhieran a éstas. Inmediatamente después, el auto-transportador EatA (EatA: autotransporter A) incluida en el grupo de las serin-proteasas (SPATEs: serine protease autotransporter of Enterobacteriaceae) inhiben la actividad de EtpA, lo que da origen a la adhesión de ECET a los enterocitos por el loci toxigénico de invasión A (Tia: toxigenic invasion loci A), una proteína de membrana externa y el loci toxigénico de invasión B (TibA: toxigenic invasion loci B) (Figura 3)69-72.

 

Figura 3. E. coli enterotoxigénica. ECET (ETEC en la figura) se une a los enterocitos
por EtpA. EatA inhibe a EtpA para lograr la adhesión por CFs, Tia y TibA. LT se une
al GM1 entrando por endocitosis y genera un aumento del AMPc. ST tiene como
receptor a GC-C, donde origina altos niveles de GMPc para terminar los dos procesos
con la secreción de cloruro y demás electrolitos por el canal CFTR.

 

Otro de los factores de colonización importantes es el longus type IV pilus, que actúa de manera semejante al BFP de ECEP e interviene en la auto-agregación bacteriana68,73,74.

Toxinas: El principal factor de virulencia de ECET es la secreción de enterotoxinas termoestables (ST: heat-stable enterotoxin) y enterotoxinas termolábiles (LT: heat-labile enterotoxin). Existen dos tipos de LT (LT-I y LT-II); las LT-I están directamente asociadas a cepas humanas. Cada toxina se divide en dos subunidades A y B72. ECET secreta, mediante el sistema de secreción tipo 2, la LT dentro de las vesículas de la membrana externa (OMVs: outer membrane vesicles)75 y posteriormente con ayuda de la subunidad B de LT se une al gangliósido GM1, que por endocitosis permite que las OMV ingresen al citoplasma. Una vez allí, se dirige al aparato de Golgi y al retículo endoplasmá-tico76 (Figura 3). La subunidad LT-A1 presente en el citosol se une, mediante ribosilación del ADP, a los nucleótidos de guanina (Gs), inhibe la actividad de GTPasa y activa la adenilatociclasa76. Estas reacciones producen un aumento del AMP cíclico, lo que estimula la secreción de cloruro y demás electrolitos a través del canal regulador transmembranal de la fibrosis quística (CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) e impide la absorción del intestino y de esta forma ocasiona diarrea secretora de amplia intensidad77 (Figura 3). En las ST, la unión está mediada por la guanilato-ciclasa-C (GC-C) y existe un aumento del GMP cíclico dependiente de la proteína quinasa II donde se produce el mismo efecto de la LT al aumentar la secreción por el CFTR78. Además, las ST tienen la capacidad de controlar la proliferación celular. Según estudios, inhibe la síntesis de ADN en células de cáncer de colon, que depende de los niveles de calcio intracelulares (Figura 3)79,80. La citolisina A (ClyA: cytolysin A) expresada del gen clyA también ha sido descrita como citotoxina de ECET cuyas funciones son la formación de poros, inducción de apoptosis en los macrófagos y actividad hemolítica81-83.

Escherichia coli enteroagregativa

Causa diarrea aguda o persistente, tanto en niños como en adultos, en países en vías de desarrollo y se identifica con frecuencia en cuadros diarreicos de personas de países industrializados y en pacientes infectados por VIH. Este patotipo se adhiere a la mucosa intestinal, la coloniza y produce un efecto citotóxico que causa diarrea de tipo acuosa sin fiebre, con secreción de moco84,85. Entre las cepas de ECEA existe gran variabilidad en la presencia de factores de patogenicidad; por consiguiente, en los modelos estudiados aún no se ha encontrado relación entre un genotipo o fenotipo específico y el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, un estudio reciente describe la asociación entre las cepas ECEA y el grupo filogenético D, principalmente en pacientes sintomáticos84.

Adherencia: La patogénesis de esta bacteria exhibe en común, la formación de microcolonias85 y un patrón de adherencia-agregativa (AA: aggregative- adherence) a células HEp-2 y HeLa descrito como "apilación de ladrillos86. ECEA presenta plásmidos pAA, que codifican varios factores de virulencia, en los que se incluye un regulador AggR perteneciente a la familia de activadores transcripcionales AraC/XylS, el que se encuentra en la mayoría de las cepas; se sugirió el término "ECEA típica" a aquellas que lo expresan87,88. Algunos genes regulados por AggR son los factores necesarios para la expresión del patrón AA que implica las fimbrias AAF con variantes I, II, III y IV (este último también llamado adhesina Hda) codificadas por los genes aggA, aafA, agg3A y agg4A89-91. Se han relacionado con la formación de microcolonias otros genes regulados por AggR, entre los que se incluyen una proteína Irp2 involucrada en la expresión de yersiniabactin (sideróforo) encontrada en especies de Yersinia, una enterotoxina de Shigella (ShET1: shigella enterotoxin 1) codificada por el gen set1A85, y por último dos proteínas Fis y YafK junto con un sistema de secreción tipo VI92. Sin embargo, se ha evidenciado la formación de microcolonias cuando están los factores regulados por AggR y también, cuando ninguno de ellos, incluyendo AggR, está presente, lo que indica la existencia de factores de virulencia aún no descritos85. En la adhesión también están involucradas proteínas de la membrana externa como Hra-1 (Hra: heat-resistant agglutinin 1) con actividad aglutinina y adhesina, Hra-2 con actividad adhesina y Tia homóloga de Hra-1 con actividad invasora y adhesina, también relacionada con cepas de ECET93. En la colonización bacteriana actúa un complejo denominado Aat que se requiere para el transporte de una dispersina codificada por el gen aap, juntos regulados por AggR y codificados en el plásmido pAA. Aat media la secreción de la dispersina desde la membrana externa de la bacteria para promover la colonización de la mucosa intestinal (Figura 4a)94,95.

 

Figura 4. E. coli enteroagregativa. a. ECEA utiliza para la adhesión las fimbrias AAF
además de una proteína Tia y unas aglutininas estables al calor (Hra 1-2). EAST es
una toxina que tiene actividad guanilatociclasa (GC) e incrementa el GMPc. En la
colonización actúa una dispersina transportada por el complejo Aat y una variedad
de SPATEs; b. Una proteasa Pic, hace parte de SPATEs no citotóxicos. Pic es capaz
de incrementar la secreción de moco, pero a su vez le abre paso a la bacteria gracias
a su actividad mucinolítica. También tiene SPATE citotóxicos como Pet, que escinde
una proteína llamada espectrina, unida a la actina, finalmente para bloquear su función
y ocasionar el redondeamiento de la célula.

 

Enterotoxinas: ECEA presenta factores no regulados por AggR como la enterotoxina 1 (EAST1: enteroaggregative E. coli heat-stable enterotoxin 1) codificada por astA, que altera el transporte de iones e induce aumento del GMPc96 y una variedad de SPATEs ci-totóxicos y no citotóxicos (Figura 4b)97. Dentro de los SPATEs se encuentran la proteasa involucrada en la colonización intestinal (Pic: protease involved in intestinal colonization) y la toxina codificada en plásmidos (Pet: plasmid-encoded toxin). Pic (grupo no citotóxicos) es una proteasa que incrementa el número de células caliciformes y la producción de moco que atrapa las bacterias auto-aglutinándolas en el epitelio intestinal, aunque su mecanismo de acción aún está en estudio. También es responsable de la actividad mucinolítica que le abre paso a través de esta capa de moco98. Pet es una SPATE citotóxica que se une a la espectrina en la membrana del complejo de Golgi, bloquea su función y causa el redondeamiento de la célula99. Adicionalmente, pueden estar presentes otras SPATEs citotóxicas como EspP (de ECST) que escinde pepsina A y el factor V de coagulación100, la toxina auto-transportadora secretada (Sat: secreted autotransporter toxin) y el homólogo de proteasa de Shigella tipo IgA (SigA: Shigella IgA-like protease homolog) descrita en cepas de Shigella flexneri100,101. SPATEs no citotóxicas como la proteína extracelular de Shigella (SepA: Shigella extracellular protein A) también descrita en Shigella flexneri, contribuye a la inflamación intestinal103.

Escherichia coli enteroinvasora

Los síntomas característicos en personas infectadas por ECEI son diarrea acuosa, con sangre, moco y dolor abdominal, pero en algunos casos sólo se presenta diarrea, lo cual la hace indiferenciable de la producida por ECET y menos grave que la causada por Shigella. Las cepas de ECEI se asocian más a brotes que a casos aislados, en los que la transmisión puede ser de persona a persona, por ingestión de alimentos y agua contaminada, convirtiéndose en un patógeno importante en niños sobre seis meses de edad2,29. Existen pocos estudios epidemiológicos que demuestran la carga mundial de la diarrea por ECEI, debido a que estas cepas suelen ser identificadas como Shigella spp5. Evidencia científica demuestra la estrecha relación filogenética y bioquímica entre estas dos bacterias104.

En los individuos infectados, ECEI evade la respuesta inmune porque entra fácilmente a las células epiteliales del colon por medio de adhesinas, moviéndose lateralmente para invadir otras células105. Escherichia coli enteroinvasora, al igual que Shigella spp, posee un plásmido de virulencia pINV que codifica para el T3SS, 25 proteínas (entre ellas OscpB, VirA, OspG) y los antígenos de invasión de plásmidos (Ipa: invasion plasmid antigens) Ipa A, Ipa B, Ipa C, Ipa D, entre otros106.

En la mucosa del colon, ECEI invade inicialmente las células M y en una vacuola fagocítica por transcitosis la bacteria atraviesa la barrera epitelial e invade los macrófagos. En éstos la proteína IpaB, lisa la vacuola en el citoplasma e induce apoptosis vía caspasa 1 para finalmente ser liberada y alcanzar el polo basolateral107-110.

Posteriormente, la bacteria ingresa a las células intestinales mediante el reconocimiento de los receptores CD44 y α5ß1 integrina gracias a ipaB y al complejo IpaBCD bacteriano. Después de su multiplicación en el citoplasma, se libera del fagosoma mediante ipgD y se desplaza lateralmente entre una y otra célula. Para esto, VirG, localizada al extremo de ECEI, promueve la aproximación de N-WASP y por medio de la polimerización de actina, se forma el complejo VirG*N-WASP*actina111. Adicionalmente, VirA, localizada al otro extremo de la bacteria, favorece la generación de protuberancias y permite el traspaso a las células proximales111 (Figura 5). En este proceso, la liberación de IL-1 por parte de los macrófagos apoptóticos y de IL-8 en los enterocitos infectados promueve la migración de polimorfonucleares, los que adicionalmente facilitan la entrada, vía luminal, de la bacteria al epitelio112.

 

Figura 5. Mecanismos de E. coli enteroinvasora y E. coli adherente invasora. A. ECEI
(EIEC en la figura) mediante transcitosis atraviesa las células M. Es fagocitada por los
macrófagos y con ayuda de IpaB es liberada. Los receptores del hospedero CD44 y
α5ß1 integrina se unen a los receptores de la bacteria IpaB y al complejo IpaBCD,
respectivamente. Se forma el complejo VirG*N-WASP*actina y VirA favorece el
proceso de invasión a células proximales; B. ECAI (AIEC en la figura) por medio del
pili tipo 1 reconoce el receptor de la célula CEACAM6 e invade.

 

Escherichia coli adherente invasora

La enfermedad de Crohn (EC) es una de las enfermedades inflamatorias del intestino, asociada la presencia en el lumen intestinal de ECAI. Es muy frecuente en el íleon; sin embargo, el proceso inflamatorio puede ocurrir en todo el tracto gastrointestinal. Escherichia coli adherente invasora se aísla con más frecuencia en la mucosa intestinal de pacientes con EC que en sanos6,8. Dentro de las principales características de la patogenicidad están la adhesión epitelial, la invasión, la supervivencia dentro de los macrófagos y la formación de biopelículas113,114.

Invasión: Esta bacteria posee dos mecanismos de invasión a la célula. Escherichia coli adherente invasora se moviliza a través de los flagelos, los que la acercan a la célula epitelial y, por medio de la adhesina FimH localizada en el pili tipo1, se une a los residuos oligomanósidos del receptor de superficie CEACAM6 de la célula hospedera (Figura 5). La invasión de los enterocitos intestinales conduce a un aumento de la estimulación de IFN-y y FNT-a, lo que genera la sobre expresión de CEA-CAM6115. El segundo mecanismo es mediante la invasión de las células M. Escherichia coli adherente invasora posee una fimbria polar larga (LPF: long polar fimbriae) que permite la aproximación a las células M113. Utiliza el mismo proceso de ECEI donde atraviesa la célula por medio de transcitosis72. Es fagocitada por los macrófagos, donde se replica dentro de los fagosomas sin estimular la muerte celular6,116 e induce en el macrófago infectado la secreción de FNT-a, el cual causa la inflamación del íleon y conlleva la formación de granulomas6,8.

Los pacientes que padecen de esta enfermedad también generan en las células epiteliales estrés del retículo endoplásmico. En respuesta a esto, el factor de transcripción XBP1 origina un aumento en la expresión de gp96 que sirve como receptor de la proteína transmembranal OmpA, generada por el factor de virulencia denominado vesículas de membrana externa (OMV: outer membrane vesicles). OmpA promueve la virulencia del patotipo al intervenir en la adhesión, invasión y la permanencia de bacterias intracelulares117,118.

Para tratar la enfermedad de Crohn, se han descrito diferentes estrategias como anticuerpos anti-integrinas, anti-factor de necrosis tumoral alfa (anti-FNTα) y agentes inmunosupresores. Más recientemente, se han realizado estudios con antagonistas de FimH para evitar la adhesión de ECAI a la célula hospedera119.

Escherichia coli adherente difusa

Estas cepas se han asociado más a procesos diarreicos de tipo agudo y persistente en niños que en adultos. Los adultos, al igual que los niños, pueden ser portadores asintomáticos.

Se conoce poco de los mecanismos de patogenicidad de ECAD a pesar de su amplio estudio120,121. Dentro de las principales características observadas en la patogénesis de ECAD están las siguientes:

• Unión mediante adhesinas a la mucosa intestinal,

• Formación de microcolonias típicas en forma de ladrillos apilados,

• La producción de citotoxinas y enterotoxinas y finalmente,

• El desarrollo de una inflamación grave de la mucosa.

Las cepas de ECAD expresan adhesinas afimbriales (Afa) y adhesinas fimbriales (Dr). Estas adhesinas se encuentran en la superficie de la membrana externa de la bacteria, confiriendo el principal mecanismo de patogenicidad122,123. Se subdividen en dos clases, la típica Afa/DrECAD y la atípica Afa/DrECAD que tienen como características la misma organización genética y la unión al factor de aceleración (hDAF: human decay-accelerating factor)124. En la clase típica Afa/DrECAD se encuentran AfaE-I, AfaE-II, AfaE-III, AfaE-V, Dr, Dr-II, F1845 y NFA-I, las cuales son codificadas por los genes afa-, dra-, daa-. Todas las adhesinas Afa/Dr se unen a hDAF (DAF, CD55), mientras que AfaE-III, Dr y las adhesinas F1845 se unen a CEACAM6125. hDAF es una glicoproteína de 70 KDa que se encuentra distribuida en todas las células de la sangre, en el epitelio del intestino, tracto genito-urinario y células endoteliales. Tiene como función regular la cascada del complemento en el paso de la convertasa C3, cumple un papel importante en la interacción entre el patógeno y las células del hospedero para favorecer la infección126.

Se conocen dos adhesinas principales de ECAD que permiten la adherencia al enterocito. Adhesina fimbrial 1845 (F1845) y la adhesina involucrada en la adherencia difusa (AIDA I: adhesin involved in diffuse adherence). F1845 es una adhesina fimbrial que pertenece a la cepa C1845 de tipo silvestre que tiene como receptor hDAF. Al originarse esta unión, ocurre un alargamiento de las microvellosidades127. La otra adhesina es AIDA-I, que pertenece a la familia de autotransportadores de membrana externa de 100 kDa y se ha encontrado en la cepa 0:126H:2128. Una vez Afa/Dr adhesina se une con los receptores de la membrana del enterocito hDAF o CEACAM6 se produce la activación de la quinasa Src, la cual es necesaria para la movilización y organización de hDAF alrededor de las bacterias129. La lesión de la membrana celular inducida por la bacteria ocasiona elongación, daño en las microvellosidades y reordenamiento de las proteínas en el citoesqueleto, lo que genera aumento de la permeabilidad del enterocito130,131. Luego de la asociación Afa/Dr, se activa la MAP quinasa (MAP: mitogen-activated protein) e induce la producción de IL-8 con la consecuente migración transepitelial de polimorfo-nucleares131. Esto favorece el daño de los enterocitos por la síntesis de citoquinas pro-inflamatorias como FNT-a e IL-1ß132 (Figura 6).

 

Figura 6. E. coli adherente difusa. Las adhesinas Afa/Dr de ECAD (DAEC en la figura)
reconocen a hDAF o CEACAM6, activa la quinasa Src que ayuda a la movilización y
organización de FAD alrededor de la bacteria y se produce elongación, pérdida de las
microvellosidades y secreción de agua y electrolitos. La activación de la vía de
señalización de MAP culmina en la síntesis de IL-8, que induce la transmigración de
polimorfonucleares (PMN). Esto estimula la síntesis de FNT-a e IL1ß en los enterocitos,
lo que causa daño celular.

 

Ensayos en vacunas

Desde hace varios años se han adelantado estudios en vacunas para reducir la exposición a los diferentes patotipos de E. coli en humanos. Se han diseñado y ensayado en diferentes modelos vacunas atenuadas, subunidades, toxoides, conjugados o fusión de antígenos multiepítopes, vacunas de vectores recombinantes y de ADN y, recientemente, una mezcla celular completa inactivada de patotipos de E. coli133-137. Algunos de estos estudios están en la fase preclínica y otros con un grado de avance mayor en los estudios clínicos. Los mayores avances en vacunas han sido en ECET. Se han investigado diferentes modelos con resultados variables en su efectividad, proteínas de algunos factores de virulencia expresados por ECET como CFs, subunidades de LT, ST, entre otros133,137,138. Para el control de las cepas de ECEP, desde hace varios años, con algunas de estas moléculas más conservadas, entre éstas la intimina, EspB, EspA y BfpA se han adelantado estudios para el desarrollo de vacunas en diversos modelos. A pesar de estos avances, aún no existen productos disponibles para el control de la infección por ECEP8,135,136,139,140.

Recientemente, se desarrolló una vacuna combinada contra cinco patotipos de E. coli. Se probó en modelos murinos una mezcla celular completa de cinco patotitpos de E. coli (ECEP, ECEA, ECEI, ECST y ECET) inactivados con formol y aplicados en forma subcutánea. La vacuna combinada mostró 100% de supervivencia de los ratones, independiente del sistema de adyuvante utilizado, ofreciendo protección contra los cinco patotipos en una sola dosis e indujo una buena respuesta humoral141. Algunas de las proteínas implicadas en la virulencia de ECST, principalmente en algunas del T3SS, las subunidades de la toxina STx y la intimina, han sido blanco para el diseño de vacunas. Actualmente, existen dos vacunas disponibles comercialmente, que tienen como función disminuir la colonización por ECST en el ganado142,143, lo que eventualmente podría disminuir el contacto de los humanos con cepas de esta variedad.

Últimamente, mediante estudios de genómica comparativa y de análisis inmunoinformático se han identificado nuevos candidatos vacunales que generan respuesta inmune y reducción de la colonización por ECST en modelos murinos134.

Los estudios en vacunas para prevenir las infecciones entéricas por E. coli y por otros microrganismos están mostrando resultados que a corto y mediano plazo permitirán plantear nuevos enfoques para generar vacunas de amplio espectro, evaluar respuesta inmune y su eficacia en las poblaciones y evaluar el papel de la inmunidad materna como mecanismo de prevención de las infecciones entéricas.

Conclusiones

Escherichia coli, por ser uno de los principales agentes causales de enfermedad diarreica infecciosa, ha sido motivo de interés en la realización de un gran número de investigaciones que contribuyen a su entendimiento. Se recopiló y analizó información actualizada sobre su patogenicidad, lo que permitió ampliar el conocimiento de los factores de virulencia y sus mecanismos de acción en el hospedero. Algunos de estas moléculas son candidatas potenciales para el desarrollo de vacunas y herramientas útiles para la caracterización molecular de las cepas de E. coli. Se debe avanzar en estudios moleculares para determinar la prevalencia específica de patógenos en las diferentes áreas geográficas y en diferentes grupos poblacionales. Así mismo, es necesario diseñar métodos que incluyan modelos inmunológicos para ampliar el conocimiento de la evolución epidemiológica de patógenos específicos.

Agradecimientos: A la Universidad de Santander, al Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico. A Claudia Pilar Lozano y Liliana Benítez por sus los valiosos aportes y la revisión de este trabajo.

 

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Recibido: 16 de mayo de 2016 (2a versión)
Aceptado:
26 de julio de 2016

Financiamiento: Fondos de Universidad de Santander. Conflictos de interés: ausentes.

Nota del Editor: las siguientes siglas han sido traducidas del inglés al español, observando el estilo de la revista, por su frecuente uso en nuestro idioma: EPEC = ECEP ETEC = ECET EIEC = ECEI. STEC = ECST. EAEC = ECEA. DAEC = ECAD AIEC = ECAI

Correspondencia a: Ana Elvira Farfán-García
afarfan@udes.edu.co

 

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