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Introducción
Vibrio cholerae es una bacteria gramnegativa que pertenece a la clase gamma del phylum Proteobacteria. Las cepas toxigénicas de V. cholerae causan el cólera, una enfermedad caracterizada por producir un tipo de diarrea secretora grave y tener alta letalidad. Para tipificar las diferentes cepas de V. cholerae se utiliza un antígeno localizado en su membrana externa denominado O, porción más externa del lipopolisacárido (LPS), correspondiendo las cepas de V. cholerae toxigénico, generalmente al tipo O1 o O139. Cepas de origen ambiental de esta bacteria presentan diversos subtipos de antígeno O denominándose en su conjunto como no-O1, no-O1391–3. Se ha descrito que algunas cepas de V. cholerae no-O1, no-O139 poseen un claro poder patógeno con la potencialidad de causar brotes o casos esporádicos de gastroenteritis e infecciones extra-intestinales fatales en humanos3–5.
A diferencia de los mecanismos de patogenicidad de las cepas de V. cholerae O1 y O139, que han sido bastante estudiados, los mecanismos de las cepas patogénicas de V. cholerae no-O1, no-O139 son bastante menos conocidos. Pionero en esta área, el grupo de Mekalanos, describió por primera vez en el año 2005 una cepa de origen clínico de V. cholerae no-O1, no-O139 que portaba en su genoma un segmento homólogo de la isla de patogenicidad VPaI-7 de V. parahaemolyticus6 (Figura 1). Dicho segmento corresponde sólo a una porción de 30 kpb localizada en el extremo 3' de la isla VPaI-7 de 80 kpb, descrita originalmente en V. parahaemolyticus. Este segmento génico codifica para un sistema de secreción tipo III (T3SS) funcional que recientemente se ha descrito como un importante factor de virulencia7–10. Existen en este segmento de isla de patogenicidad de V. parahaemolyticus una serie de genes denominados “Vibrio cholerae secretion” (vcs), que codifican para varios componentes estructurales (vsc C, J, R, T, Q, V, U) del sistema de secreción T3SS2, que en conjunto otorgan un mayor grado de virulencia7. Otro gen localizado en esta isla es el denominado vcsN2, responsable de codificar para una ATPasa que brinda la energía necesaria para conducir la secreción por medio del complejo de poro. Estudios recientes indican que este último gen sería esencial para la colonización del epitelio intestinal en animales7. Además, el gen denominado vopF, localizado también en la misma isla, sería importante en el fenómeno de la colonización intestinal por parte de V. cholerae no-O1, no-O1397,9. Este último gen codifica para una proteína que es capaz de alterar la organización del citoesqueleto de actina en eucariontes, lo que puede comprometer la integridad de las uniones estrechas en el epitelio intestinal, producto de una inducción de la despolimerización cortical en las fibras de actina. Otros dos genes de virulencia presentes en este tipo de cepas, denominados hylA (hemolisina VCC) y rtxA (repeats in toxin), y que se encuentran fuera de la isla, también fueron analizados en este estudio1. En nuestro país, se han reportado dos casos clínicos causados por cepas de V. cholerae no-O1, no-O139 que presentan un segmento de la isla de patogenicidad VPaI-73,4.
Figura 1 Organización estructural del segmento de la isla de patogenicidad VPaI-7, la que fue descrita originalmente en cepas de V. cholerae no-O1, no-O139 por Dziejman y cols. 20056.
En un estudio anterior, el genoma de la cepa septicémica NN1, aislada en Valparaíso en 2006, fue secuenciado mediante las plataformas Illumina y 454 (Roche) (manuscrito en preparación). Los genes de virulencia vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF, fueron localizados en la isla genómica VPaI-7 mediante el uso de la plataforma pública BLAST (NCBI) y del programa GCK.
El objetivo de este trabajo fue detectar y conocer la prevalencia de los genes de virulencia codificados en el segmento de isla de patogenicidad VPaI-7: vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF, en cepas chilenas clínicas de V. cholerae no-O1, no-O139. Adicionalmente se determinó la presencia de los genes de virulencia hylA y rtxA, localizados fuera de la isla de patogenicidad.
Métodos
Cepas estudiadas:
Las cepas de V. cholerae que se utilizaron en este estudio fueron identificadas con técnicas tradicionales de cultivo en medios selectivos (TCBS y Chromoagar Vibrio) y pruebas serológicas contra los antígenos O1 y O139 (antisueros V. cholerae O139 Bengala y O1 polivalente, serotipo Inaba y Ogawa, Denka Seiken).
En este estudio se utilizaron en total nueve cepas chilenas de origen clínico de V. cholerae no-O1, no-O139 aisladas entre 2006-2012 (Tabla 1). Las cepas NN1, NN2 y NN9 fueron obtenidas a partir de casos clínicos aislados. Las cepas NN3-NN8 corresponden a cepas obtenidas de un brote epidémico ocurrido en Antofagasta en 2010. Todas estas cepas se conservaron criopreservadas a −80° C en glicerol al 15%.
Tabla 1 Cepas chilenas de origen clínico de V cholerae no-O1, no-O139 analizadas en este trabajo
| Nombre Cepa | Año | Ciudad | Cuadro clínico | Origen muestra |
|---|---|---|---|---|
| NN1 | 2006 | Valparaíso | Septicemia | Sangre |
| NN2 | 2009 | Santiago | SDA | Deposición |
| NN3 | 2010 | Antofagasta | SDA | Deposición |
| NN4 | 2010 | Antofagasta | SDA | Deposición |
| NN5 | 2010 | Antofagasta | SDA | Deposición |
| NN6 | 2010 | Antofagasta | SDA | Deposición |
| NN7 | 2010 | Antofagasta | SDA | Deposición |
| NN8 | 2010 | Antofagasta | SDA | Deposición |
| NN9 | 2012 | Santiago | SDA | Deposición |
SDA: Síndrome diarreico agudo.
Detección de los genes TTSS2 de la isla de patogenicidad VPaI-7 en base al genoma de cepa NN1 de V. cholerae no-O1, no-O139 en cepas clínicas de V. cholerae no-O1, no-O139.
Utilizando el genoma de la cepa septicémica NN1, aislada en Valparaiso en 2006, se localizaron los genes de virulencia vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vop F, codificados en la isla genómica VPaI-7. Para ello se utilizó la plataforma pública BLAST (NCBI) y del programa GCK (versión 2.5; Textco, West Lebanon, NH).
Ensayos de reacción de polimerasa en cadena (RPC) convencional.
Cada par de partidores fue diseñado en base a la secuencia genómica obtenida de la cepa septicémica NN1 (Tabla 2). Para los ensayos de RPC se utilizó la siguiente mezcla de reacción: tampón (Promega) 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTPs 200 μM, 25 pmol de cada partidor y 2U de Taq polimerasa. El volumen final de cada reacción fue de 50 μl. Finalmente, se adicionó a esta mezcla 1μl de ADN genómico de cada cepa purificado mediante el kit Genomic DNA QIAGEN. Los tiempos y temperaturas utilizadas para configurar los termocicladores (Minicycler™ de MJ Research y G-STORM 482) fueron los siguientes: desnaturalización inicial a 95°C por 5 min. Luego 30 ciclos de amplificación, consistiendo cada uno de ellos en: 30 s a 95°C, 30 s a 58°C y 1 min 30 s a 72°C. Para finalmente realizar una extensión final a 72°C.
Tabla 2 Partidores diseñados en este estudio y utilizados en la tipificación de cepas chilenas de origen clínico de V cholerae no-O1, no-O139
| Partidores | Secuencia | Tamaño (pb) |
|---|---|---|
| VCNN-N2f | 5′-CAA TCG CAG GAT AAC GTC CT-3′ | 874 |
| VCNN-N2r | 5′-CGA GGC GAA ATT GTC AAA GT-3′ | |
| VCNN-C2f | 5′-CTC GAG GAG GGT TAA TGT CG-3′ | 1050 |
| VCNN-C2r | 5′-GCG CAG GCA GAT GTT TTT AT-3′ | |
| VCNN-V2f | 5′-ATT GCA CAA GTA GCC GCT TT-3′ | 1438 |
| VCNN-V2r | 5′-GAA ACC GTC GGT CAG TTT GT-3′ | |
| VCNN-VopFf | 5′-CTG CCG TCA ATT TGG AAG AT-3′ | 1265 |
| VCNN-VopFr | 5′-AAG TGC TGC CAA TTG AGC TT-3′ | |
| VCNN-VspDf | 5′-CTT GCT CAA TTC GTG TTT GC -3′ | 853 |
| VCNN-VspDr | 5′-AAC CAA CCT CAG CAA CAA GC-3′ | |
| VCNN-ToxR2f | 5′-ACA GGA GCC AAC TGG GTT TA-3′ | 369 |
| VCNN-ToxR2r | 5′-TGC TGT GTG AAA ATG CCA AT-3′ | |
| VCNN-HylAf | 5′-AGA TCA ACT ACG ATC AAG CC-3′ | 1677 |
| VCNN-HylAr | 5′-AGA GGT TGC TAT GCT TTC TAC-3′ | |
| VCNN-RtxAf | 5′-GCG ATT CTC AAA GAG ATG C-3′ | 1366 |
| VCNN-RtxAf | 5′-CAC TCA TTC CGA TAA CCA C-3′ |
Los amplicones se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 0,8%. Se utilizó el kit GoTaq Flexi DNA polymerase (Promega). Se cargó 4 μl de producto en cada carril. Los geles fueron corridos a 50 V por 90 min en tampón TAE 0,5X en cámara Minigel migration Tank, Gel X Labnet. Para visualizar los resultados se utilizó un transluminador UV (Espectroline® modelo TUC-312R). Los geles fueron capturados digitalmente con el programa KODAK EDAS290 y analizados mediante el software Kodak 1D v3.6. En cada reacción se utilizó los siguientes controles: control positivo cepa NN1; control negativo: cepa toxigénica de V. cholerae O1 denominada N16916, la que no presenta la isla de patogenicidad VPaI-7.
Ensayos de repetitive element palindromic PCR (REP-PCR) y Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR).
Los partidores utilizados en esta técnica fueron obtenidos de Versalovic et al. 199111: VpREP1: 5'-IIIICGICGICATCIGGC-3’
VpREP2: 5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3’
VpERIC-1: 5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’
VpERIC-2: 5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’
La mezcla de reacción utilizada para ambos ensayos se basó en el protocolo descrito por Rao y cols., 2010, con modificaciones menores: tampón (Promega) 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTPS 200 μM, 25 pmol de cada partidor y 3U de Taq polimerasa12. El volumen final de cada reacción fue de de 25 μl. Finalmente, se le adicionó 2 μl de ADN genómico purificado mediante el kit Genomic DNA QIAGEN. La RPC se realizó en ambos casos en un termociclador Eppendorf (Mastercycler Gradient) con los siguientes pasos: desnaturalización inicial a 95°C por 7 min, 30 ciclos de 90°C por 30 s, 45°C por 1 min y 65°C por 3 min. Extensión final a 70°C por 10 min.
Análisis de similitud SABy dendrograma.
Para calcular la similitud genética (SAB) entre las cepas se utilizó el coeficiente de Dice. Con dichos datos se construyó luego un dendrograma mediante un análisis de agrupamiento por UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic averages). Estos análisis se realizaron con ayuda del Programa Treecon v1.3b para windows.
Resultados
El genoma de la cepa septicémica NN1 fue secuenciado mediante la plataforma de secuenciación masiva Illumina y 454. En su genoma se detectó el segmento génico que corresponde al extremo 3' la isla VPaI-7 de V. parahaemolyticus4. En base a dicha secuencia se diseñaron todos los partidores utilizados en este trabajo. Los fragmentos de RPC obtenidos para cada reacción fueron del tamaño esperado.
El análisis de las nueve cepas de origen clínico de V. cholerae no-O1, no-O139 (incluyendo la cepa clínica control NN1), demuestra que 6/9 cepas fueron positivas para los genes T3SS2. Sólo las cepas NN3, NN4 y NN9 mostraron un perfil de virulencia diferente, destacando la cepa NN9 que fue negativa para la totalidad de dichos genes (Tabla 3). Por otra parte, destaca que las nueve cepas fueron positivas para los marcadores rtxA y hlyA.
Tabla 3 Patrones de amplificación de los diferentes genes de virulencia presentes en las cepas chilenas de origen clínico de V cholerae no-O1, no-O139
| Cepa | Localidad | Año | vcsN2 | vcsC2 | vcsV2 | vopF | vspD | toxR2 | rtxA | hylA |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| NN1 | Valparaíso | 2006 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| NN2 | Santiago | 2009 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| NN3 | Antofagasta | 2010 | + | + | + | + | − | + | + | + |
| NN4 | Antofagasta | 2010 | + | + | + | + | − | + | + | + |
| NN5 | Antofagasta | 2010 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| NN6 | Antofagasta | 2010 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| NN7 | Antofagasta | 2010 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| NN8 | Antofagasta | 2010 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| NN9 | Santiago | 2012 | − | − | − | − | − | − | + | + |
Los ensayos de REP-PCR y ERIC-PCR demostraron la presencia de cuatro perfiles genómicos dentro de este grupo (Figura 2). En la Figura 3 se muestra el dendrograma obtenido en base a REP-PCR (dada la estrecha concordancia entre ambos ensayos sólo se muestra el resultado del REP-PCR).
Discusión
Este trabajo muestra por primera vez que un grupo heterogéneo temporalmente y geográficamente de cepas chilenas de origen clínico de V. cholerae no-O1, no-O139 portan los genes de virulencia vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF, recientemente reconocidos como bona fide factores de virulencia en modelo murino7–10. Es importante destacar que estos genes participan en la estructuración y funcionamiento de un sistema de secreción tipo III (denominado en este caso T3SS2). Los sistemas T3SS conforman una especie de “jeringa molecular” que introduce o inyecta directamente toxinas al citoplasma de la célula blanco del hospedero13. El gen vcsN2 codifica para una ATPasa que participa en el fenómeno de secreción. El gen vopF (vibrio outer protein F) participa en la regulación del proceso y los genes vcsC2, vcsV2 y vspD desempeñan un papel estructural10. Por otra parte, el gen toxR, perteneciente a una familia de reguladores transcripcionales, codifica para la proteína ToxR, la que se une al ADN a través de un dominio HTH, que es necesario para la regulación transcripcional positiva y/o negativa de múltiples genes14. Además, las cepas fueron positivas para los genes de virulencia hylA y rtxA, localizados fuera de la isla de patogenicidad, ambos reconocidos como importantes buscar un sinónimo exotoxinas de estas bacterias1. La hemolisina codificada por el gen hlyA, denominada también VCC (Vibrio cholerae cytolysin), es un importante factor de virulencia que actúa como citotoxina formadora de poros en membranas15. Por otra parte, el gen rtxA codifica para una exotoxina perteneciente a la superfamilia de las toxinas RTX que también tienen actividad citotóxica y citolítica16.
La localización de este T3SS en una isla de patogenicidad cromosomal podría facilitar la diseminación de estos factores en la población natural de cepas de V. cholerae no-O1, no-O139, a través de transferencia genética horizontal, favoreciendo el surgimiento de nuevos clones patogénicos. Aunque el mecanismo de movilización horizontal de las islas patogénicas cromosomales no es del todo conocido, existe evidencia experimental que indica que dichas islas se pueden transferir de manera parcial o total17. La presencia del grupo de genes de virulencia vcs podría indicar un mayor grado de virulencia de la cepa portadora, y por lo tanto, condicionar la gravedad del cuadro clínico. Por otra parte, la detección de este grupo de genes podría ser de utilidad para el control ambiental y de alimentos marinos de consumo humano. Según datos no publicados de nuestro laboratorio, alrededor de 40% de las cepas de V. cholerae no-O1, no-O139 de origen ambiental contienen este mismo segmento génico (manuscrito en preparación). Esto indicaría que este tipo de cepas se encuentra distribuido ampliamente en el ambiente acuático local, lo que sugiere que nuestra población estaría expuesta permanentemente a casos esporádicos y eventualmente brotes epidémicos por este tipo de Vibrio.
Aun siendo un grupo pequeño de cepas clínicas, varias de ellas provienen de lugares y tiempos diferentes, lo que sugiere un origen no clonal. Esta idea fue evaluada por el uso de dos técnicas de genotipicación global como REP-PCR y ERIC-PCR. Estas técnicas permiten comparar perfiles globales de genomas bacterianos y establecer grados de similitud18. Ambas técnicas fueron concordantes en mostrar cuatro diferentes perfiles genómicos en el grupo de cepas estudiadas, lo que sugiere que estas cepas no conforman un grupo clonal.
Finalmente, estos hallazgos deberían incentivar una actitud de cautela y precaución respecto del consumo de productos marinos crudos en nuestro Chile, sobre todo para grupos de riesgo, por la posibilidad de infectarse con cepas patogénicas pertenecientes a este subgrupo de vibriones.
Conclusiones
La mayoría (6/9) de las cepas chilenas de origen clínico de V. cholerae no-O1, no-O139 presentó amplificación para los genes de secreción vcsN2, vcsC2, vcsV2, vspD, toxR2 y vopF, todos ellos presentes en el segmento de isla de patogenicidad VPaI-7. Dos cepas (NN3 y NN4) amplificaron el mismo conjunto de genes excepto el gen vspD. Sólo una cepa (NN9) no amplificó gen vcs alguno. Respecto a los genes de virulencia rtxA y hylA, localizados fuera de la isla, todas las cepas fueron positivas para ambos.
Estos resultados sugieren fuertemente la posibilidad que dichas cepas posean un potencial de virulencia importante en seres humanos y que, por lo tanto, debiera mantenerse una conducta de cautela permanente frente al consumo de productos marinos crudos que puedan eventualmente contagiar a grupos de riesgo de nuestra comunidad.
