nueva página del texto (beta)
Español (pdf)
Articulo en XML
Traducción automática
Citado por SciELO 
Citado por Google 
Similares en
SciELO 
Similares en Google 
Permalink
Introducción
Pseudomonas aeruginosa es uno de los principales agentes etiológicos de infecciones asociadas a la atención de salud (IAAS), tanto en Chile como mundialmente1. En nuestro país, la letalidad asociada se ha calculado para dos patologías: neumonía asociada a ventilación mecánica (NAVM): 12,1% en neonatos, 25,3% en adultos y 14,4% en niños, y para infecciones del torrente sanguíneo asociado a catéter venoso central (ITS CVC): 4% en neonatos, 12,7% en adultos y 6,8% en niños2.
En los últimos años se ha observado un aumento en la prevalencia de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, las que además presentan resistencia múltiple a otros antimicrobianos, dificultando su tratamiento y se asocian a mayor mortalidad3.
La resistencia a carbapenémicos puede explicarse por diversos mecanismos que poseen las bacterias; sin embargo, la presencia de carbapenemasas es uno de los más preocupantes por su amplio espectro hidrolítico y por su gran capacidad de diseminación, cuando los genes que las codifican se encuentran contenidos en plásmidos4.
En el mundo, la presencia de carbapenemasas en P. aeruginosa se ha descrito en Europa, Asia y América siendo la principal las de tipo VIM5,6. Sin embargo, desde hace aproximadamente una década se han reportado P. aeruginosa productoras de KPC en varios países de Asia y América7,8. Las bacterias que poseen blaKPC tienen repercusión tanto clínica como epidemiológica; además, se asocian con una mayor resistencia a otros β-lactámicos y se han descrito en brotes de IAAS9.
En Chile, en el bienio 2004-2005, nuestro grupo detectó por primera vez la presencia de carbapenemasas del tipo VIM en 18,6% de las cepas de P. aeruginosa con susceptibilidad disminuida a imipenem10.
El objetivo actual fue estudiar la presencia de carbapenemasas de clase A y B de Ambler en las cepas de P. aeruginosa con susceptibilidad disminuida a imipenem y/o meropenem, en el mismo hospital universitario, al cabo de una década de la anterior evaluación.
Métodos
Estudio retrospectivo de las cepas aisladas de pacientes, entre enero de 2014 y septiembre de 2015, en el Laboratorio de Microbiología del Hospital Clínico de la Universidad Católica.
Métodos microbiológicos
Las cepas permanecieron almacenadas a -20° C hasta el actual estudio. En caso que un paciente tuviera más de un aislado, se consideró eventos infecciosos diferentes si había más de 30 días entre ambos aislamientos. La identificación de especie de todos los aislados fue confirmada por espectrometría de masas con MALDI-TOFF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
La susceptibilidad fue determinada por método de dilución en agar para los antimicrobianos con actividad anti-pseudomónica, tales como ceftazidima, cefepime, amikacina, ciprofloxacina, piperacilina/tazobactam, imipenem, meroperem y colistina. Se utilizaron los puntos de corte descritos por el CLSI11.
Detección de carbapenemasas
A las cepas con susceptibilidad disminuida a los carbapenémicos se les realizó test carbaNP “in house” según lo descrito por CLSI 201511.
Métodos moleculares
Las cepas con resultado positivo para carbaNP fueron estudiadas genotípicamente por reacción de polimerasa en cadena (RPC) para los genes blaVIM, blaVIM-1, blaVIM-2, blaIMP, blaNDM, blaKPC, blaOXA y blaIMI. Los partidores utilizados para cada RPC están especificados en la Tabla 1. Se incluyó en cada RPC un control negativo de reactivos (H2O libre de nucleasas) y un control positivo de ADN de enterobacterias portadoras de los distintos genes de carbapenemasas. El protocolo de amplificación utilizado fue obtenido desde Wozniak y cols12. La caracterización del tipo de KPC se realizó por secuenciación utilizando los partidores KPC-up y KPC-dw (Tabla 1) obtenido de Shen y cols.13. El producto de RPC obtenido fue purificado y secuenciado mediante el servicio otorgado por Macrogen. Las secuencias fueron analizadas y corregidas utilizando la aplicación online Clustal Omega y el software Chromas id. Posteriormente, las secuencias corregidas fueron alineadas con los distintos alelos de KPC disponibles en la base de datos online GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Tabla 1 Secuencia de los oligonucleótidos utilizados para la RPC en la detección de carbapenemasas
| Nombre | Secuencia | Tamaño del producto RPC (pb) | Referencia | |
|---|---|---|---|---|
| blaKPC | KPC F | 5´-TGTCACTGTATCGCCGTC-3` | 1010 | 18 |
| KPC R | 5`-CTCAGTGCTCTACAGAAAACC -3` | |||
| blaIMI | IMI-A | 5`-ATAGCCATCCTTGTTTAGCTC-3` | 818 | 19 |
| IMI-B | 5`-TCTGCGATTACTTTATCCTC-3` | |||
| blaVIM | VIM S | 5´- CCGATGGTGTTTGGTCGCAT-3´ | 391 | 10 |
| VIM AS | 5´- GAATGCGCAGCACCAGGAT- 3´ | |||
| blaNDM-1 | NDM1 F | 5´- CGGGGCAGTCGCTTCCAAGG-3´ | 295 | 20 |
| NDM1 R | 5´- CCAGCCATTGGCGGCGAAAG-3 | |||
| blaIMP | IMP S | 5´-AAAGA TACTGAAAAGTTAGT-3´ | 446 | 10 |
| IMP AS | 5´-TCYCCAAYTTCACTRTGACT-3´ | |||
| blaOXA-48 | OXA-48A | 5`- TTGGTGGCATCGATTATCGG-3` | 744 | 21 |
| OXA-48B | 5`- GAGCACTTCTTTTGTGATGGC-3` | |||
| blaVIM-1 | VIM-G1-F | 5`ATGTTAAAAGTTATTAGTAGTTTATTG-3` | 801 | 22 |
| VIM-G1-R | 5`- CTACTCGGCGACTGAGC-3` | |||
| blaVIM-2 | VIM-G2-F | 5`- ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG-3` | 801 | 22 |
| VIM-G2-R | 5`- CTACTCAACGACTGAGCG-3` | |||
| blaKPC-2 | KPC-Up | 5'-GCTACACCTAGCTCCACCTTC-3' | 968 | 13 |
| KPC-Dw | 5'-ACAGTGGTTGGTAATCCATGC-3' |
RPC: reacción de polimerasa en cadena.
Tipificación molecular
El análisis de clonalidad se realizó exclusivamente en las cepas portadoras de blaKPC. Se evaluó por método de electroforesis en gel de campo pulsado, usando SpeI como enzima de restricción, según lo descrito por Maslow y Lutsky14, interpretada según los criterios de Tenover y cols15.
Resultados
De las 459 cepas de P. aeruginosa aisladas, 300 de ellas presentaban susceptibilidad disminuida a carbapenémicos (65,3%). De éstas, 183 estaban disponibles o viables para estudio, correspondientes a 164 pacientes.
De las 183 muestras estudiadas, 129 (70%) correspondían a pacientes hospitalizados y 54 (30%) a pacientes ambulatorios. El origen de las muestras fue: respiratorias (n: 70), orina (n: 50), secreción de herida (n: 22), hemocultivos (n: 8), cultivos de punta de catéter venoso central (n: 6), otros sitios (n: 17) y vigilancias (n: 10).
De los 183 aislados estudiados, el test de carbaNP fue positivo en 44 (24%).
Los resultados de la RPC confirmaron la presencia de carbapenemasas en todas las cepas con test carba NP positivo. Los genes de resistencia encontrados fueron: blaVIM-2 en 35 cepas y blaKPC-2+VIM-2 en siete cepas y blaKPC-2 en dos cepas. De éstas 79,5% correspondían a muestras de hospitalizados y 20,5% ambulatorios. El 40,9% de las muestras eran de origen respiratorio.
Todos los aislados con blaKPC-2 provenían de pacientes hospitalizados de muestras respiratorias (n: 3), orinas (n: 2), punta de catéter venoso central (n: 1), secreción de herida operatoria (n: 1), y vigilancias (n: 2). Una de cada cinco cepas (20%) de P. aeruginosa productoras de carbapenemasas poseen el gen blaKPC-2, lo que representa 4,9% del total con susceptibilidad disminuida. De las nueve cepas de P. aeruginosa portadores del gen blaKPC solo o en asociación con VIM-2 se realizó electroforesis de campo pulsado en siete cepas, resultando todas clonales (Figura 1).
Figura 1 Estudio de clonalidad en cepas de P. aeruginosa blaKPC-2. Carril 1: control enzima restricción. Carril 2: ladder. Carriles 3 al 9, pacientes 1 al 7.
Se comparó el patrón de resistencia de las cepas de P. aeruginosa no portadoras de carbapenemasas con aquellas cepas que sí las presentaban (Figura 2), observándose una diferencia estadísticamente significativa para amikacina (36 vs 68%; P = 0,01), ceftazidima (58 vs 93%; P = 0,005), cefepima (26% vs 91%; P = 0,002), cefoperazona/sulbactam (55% vs 95%; P = 0,001) y piperacilina/tazobactam (58% vs 93%; P = 0,01). No hubo diferencia significativa en ciprofloxacina (56% vs 66%; P = 0,3) ni en colistina (16% vs 23%; P = 0,6), destacando que una de cada cinco P aeruginosa con susceptibilidad disminuida a carbapenémicos era también resistente a colistina.
Figura 2 Cepas de P. aeruginosa con susceptibilidad disminuida a carbapenémicos. Las cepas con carbapenemasas presentan una mayor resistencia a distintos antimicrobianos estudiados.
Por último, en la Figura 3 se muestran las diferencias en el patrón de susceptibilidad entre las cepas VIMvsKPC. Nuestros resultados muestran que no hubo diferencia significativa para la mayoría de los antimicrobianos, excepto ciprofloxacina en que se observó una resistencia de 57% en VIM vs 100% en KPC (P = 0,01).
Discusión
Pseudomonas aeruginosa posee múltiples mecanismos de resistencia a carbapenémicos, siendo los más frecuentes la presencia de porinas y la sobre-expresión de bombas de expulsión. Sin embargo, las carbapenemasas son un problema médico y de salud pública, ya que las infecciones producidas por bacterias que poseen carbapenemasas tienen un peor pronóstico para el paciente y limitan el enfrentamiento terapéutico debido a que muy pocos antimicrobianos son eficaces para su manejo16.
Datos nacionales describen entre 10 y 30% de resistencia a carbapenémicos, sin precisar los mecanismos de resistencia asociados17,18. En el bienio 2004-2005, nuestro centro reportó 15,3% de resistencia a imipenem en P. aeruginosa, de las cuales 18,6% presentaban carbapenemasas del tipo VIM10. Con la finalidad de complementar los resultados del período 2004-2005, en el presente estudio se incluyó la evaluación de meropenem observando que 65,3% de las cepas presentaban susceptibilidad disminuida a algún carbapenémico (imipenem o meropenem), lo que representa un aumento significativo y preocupante en la resistencia a estos antimicrobianos. Además, determinamos que este aumento no es explicado por un aumento en las carbapenemasas. Si bien, entre ambos estudios, se observó un aumento porcentual de estas enzimas desde 18,6% a 24%, este incremento no es significativo, destacándose la aparición de KPC (4,5%) sola o asociada a VIM (16%).
Pseudomonas aeruginosa productora de KPC ha sido descrita en Colombia19, Brasil20, Argentina21, E.U.A.22 y Puerto Rico23, todas del tipo KPC-2; en este último país se ha descrito también KPC-5.
Al evaluar el patrón de susceptibilidad se constató que las cepas blaKPC-2 y blaKPC-2+VIM-2 tienen resistencia, con una frecuencia que oscila entre 89% y 100%, a todos los antimicrobianos evaluados, excepto colistina y amikacina.
El hallazgo de P. aeruginosa blaKPC-2 sola o en asociación con VIM tiene implicancias terapéuticas y en el control de infecciones. Desde el punto de vista terapéutico, el hecho de que KPC esté asociado a VIM hace que aquellos antimicrobianos muy activos para KPC, pero no para metalo-β-lactamasa como ceftazidima/avibactam, tengan menos efectividad. A su vez, la capacidad de transmisión de KPC obliga a extremar las medidas de control de infecciones.
El hecho de que siete cepas de P. aeruginosa productora de KPC sean clonales, da cuenta de la importante capacidad de diseminación de este agente, lo que ya ha sido descrito en otros países24, sugiriendo que estos aislamientos deben ser cuidadosamente monitorizados para prevenir brotes.
Limitaciones de nuestro trabajo son, por una parte, que reúne información de un sólo centro universitario, por lo que nuestros resultados podrían no ser extrapolables a otros hospitales del país. Por otra parte, los datos de resistencia a colistina podrían estar sobre-estimados ya que el método utilizado en los años en que fue realizado el estudio no se considera en la actualidad el método de referencia25.
Conclusiones
Nuestro estudio muestra que 65,3% de las cepas de P. aeruginosa presentan susceptibilidad disminuida a algún carbapenémico (imipenem o meropenem) y que, aproximadamente un tercio de ellas, presenta alguna carbapenemasa, especialmente del tipo VIM. Reportamos la presencia de carbapenemasas del tipo KPC en P. aeruginosa en nuestro país ya sea sola o asociada a la presencia de VIM.
