ASPECTOS ULTRAESTRUTURALES DE TROMBOCITOS, EOSINOFILOS Y HETEROFILOS DE Caiman crocodilus yacare (Daudin, 1802) (Reptilia, Crocodilia)

ULTRASTRUCTURAL OBSERVATIONS OF THROMBOCYTES, HETEROPHILS
AND EOSINOPHILS IN Caiman crocodilus yacare (Daudin, 1802) (Reptilia, Crocodilia)

 

* ** **

Weber Leal de Moura Luiz Waldemar Oliveira Mizue Imoto Egami

* UNIFESP/EPM - Depto. de Medicina - Disciplina de Hematología
** UNIFESP/EPM - Depto. de Morfología - Disciplina de Histología

RESUMEN:Fueron utilizados 10 ejemplares de Caiman crocodilus yacare provenientes del municipio de Cáceres (Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil), a cada uno de los cuales les fueron extraidos 5ml de sangre periférica. Las muestras obtenidas fueron utilizadas para análisis ultraestructurales, referentes a trombocitos, eosinófilos y heterófilos. Los trombocitos son de forma elíptica, poseen citoplasma abundante sólo en los polos y su núcleo presenta surcos profundos o hendiduras acentuadas, mostrando algunos poros en su envoltura. Su citoplasma contiene abundantes túbulos y vesículas electrolúcidas del sistema canalicular. Son observados vacúolas con cuerpos densos y microtúbulos. Los heterófilos poseen formato aproximadamente esférico y núcleo excéntrico o periférico. Su citoplasma está repleto de gránulos polimórficos de formas de huso, en baqueta, oval o esférica, con superficie, en general, irregular. Los eosinófilos son esféricos y de núcleo lenticular excéntrico o periférico. El citoplasma contiene gránulos esféricos u ovales. Cabe destacar la presencia de gránulos citoplasmáticos voluminosos con diferencias en la electrodensidad, de superficie uniforme, pudiendo contener una estructura interna heterogénea. En heterófilos y eosinófilos, el núcleo presenta heterocromatina, eucromatina, nucléolo y la envoltura nuclear es porosa.

PALABRAS CLAVE: 1. Caiman; 2. Células de la sangre; 3. Ultraestructura.

INTRODUCCION

Actualmente "el caiman del pantanal" (Caiman crocodilus yacare) ha despertado interés económico por parte de pecuaristas, que comenzaron su crianza en cautiverio con finalidades comerciales. Como se trata de un animal silvestre, la crianza en régimen artificial hace necesario conocer la fisiopatología y, en especial, la hematología de este animal.

En ese sentido, a pesar de que las primeras nociones sobre los elementos figurados de la sangre de reptiles han surgido en el siglo XVII, la literatura específica referente a la ultraestructura de esos elementos en cocodrilos es escasa. Así, la literatura relativa a este trabajo incluye investigaciones realizadas en sangre periférica de varias otras familias de reptiles y de vertebrados no mamíferos, pero, siempre que fue posible, se buscó destacar específicamente la de cocodrilos.

En relación al estudio ultraestructural, debe ser destacado el trabajo realizado en leucocitos de aves, reptiles, anfibios y peces por KÉLENYI & NÉMETH en 1969. En esto trabajo los autores observaron algunas características ultraestructurales de los gránulos de heterófilos y eosinófilos en los vertebrados referidos, comparando con gránulos encontrados en esos mismos tipos celulares en mamíferos, incluyendo al Hombre.

MAXWELL & TREJO (1970) contribuyeron de manera importante a la comprensión de la ultraestructura de células sanguíneas de reptiles, cuando publicaron un trabajo relativo a los glóbulos blancos y trombocitos de aves domésticas, animales pertenecientes a un Orden filogenético de origen común al de los reptiles, describiendo minuciosamente cada tipo celular observado. Los heterófilos se presentaron esféricos, con pseudópodos cortos, siendo noto rios los gránulos citoplasmáticos esféricos o fusiformes, de electrodensidad variable. Los eosinófilos mostraron núcleo conteniendo tanto heterocromatina como eucromatina, nucléolo, contorno celular irregular con pseudópodos y vesículas de pinocitosis. Los trombocitos exhibieron núcleo heterocromático, vacuolas citoplasmáticas, retículo endoplasmático granular (REG), extensos microtúbulos, cuerpos densos multivesiculados y gránulos de glucógeno, en el citoplasma. MAXWELL & TREJO describen también la presencia de basófilos, linfocitos y monocitos.

La sangre periférica del tiburón Heterodontus portusjacksoni, particularmente los trombocitos, fueron estudiados por STOKES & FIRKIN (1971), en sus aspectos ultraestructurales y funcionales. Estos autores observaron semejanzas en la morfología y en algunas propiedades fagocíticas de los granulocitos de este animal con la de otros mamíferos. Además de la actividad fagocítica de los granulocitos, relataron también tal característica en los trombocitos de este elasmobranquio.

FERGUSON (1976), estudiando sangre del pez Pleuronectes platessa, describió la ultraestructura de trombocitos y de leucocitos, a través de la utilización de técnicas "in vitro" y demostró elevada actividad fagocítica de partículas de carbono por los trombocitos.

El análisis ultraestructural fue realizado por DESSER & WELLER (1979) quienes describieron la ultraestructura de eritrocitos y de trombocitos, complementando los estudios realizados en trabajos anteriores relativos a las células sanguíneas de Sphenodon punctatus. Al microscopio electrónico, los trombocitos presentaron núcleo identado y con poros, heterocromatina de localización periférica, además de la presencia en el citoplasma, de microtúbulos, ribosomas, mitocondrias, vacuolas con o sin material denso, así como gránulos de glucógeno.

Los sistemas de membranas de trombocitos de aves fueron estudiados por DAIMON & UCHIDA (1978), con o sin tratamiento previo con rojo de Rutenio, seguido de observación al microscopio electrónico. Al mismo tiempo, realizaron también investigaciones incluyendo la aplicación de un método citoquímico electrónico para la determinación del sitio preciso de la actividad de la peroxidasa en los trombocitos.

En relación a trombocitos, con el enfoque para la distribución del sistema canalicular conectado a la superficie de la célula, fue desarrollado un estudio en ranas por DAIMON et al. (1979), después de la aplicación del método clásico para microscopía electrónica, fijación con ácido tánico y con el empleo del rojo de Rutenio. DAIMON et al. (1987) retomaron las investigaciónes sobre trombocitos, utilizando los métodos ultraestructural y citoquímico para la caracterización de ese sistema canalicular en la tortuga terrestre Geoclemys reevessi.

PAGE & ROWLEY (1983) realizaron microscopía electrónica de todos los tipos de leucocitos de la lamprea de río Lampetra fluviatilis, destacando un tipo de granulocito análogo al heterófilo/neutrófilo de los vertebrados superiores. Estos autores admitieron la existencia de tres tipos de gránulos citoplasmáticos en los leucocitos granulocitos, de acuerdo con el tamaño, la forma y la electrodensidad.

El análisis ultraestructural de leucocitos de la sangre de peces fue realizado en la especie Oreochromis mossambicus por DOGGET & HARRIS (1989). Relataron la presencia de diferentes tipos de granulocitos (1, 2 y 3), basándose en las características ultraestructurales de los gránulos citoplasmáticos. En relación al granulocito tipo 1, consideraron que era análogo al neutrófilo de mamífero. Con respecto al granulocito tipo 2 fue descrito que presentaba pequeños pseudópodos y gránulos electrodensos esféricos, de apariencia homogénea y, en algunos casos, cierta granulosidad.

AZEVEDO & LUNARDI (1995) y LUNARDI & AZEVEDO (1995) se preocuparon en diferenciar los heterófilos de los eosinófilos debido a las discusiones existentes en la literatura, en cuanto a la identificación de estos tipos celulares. En el primer trabajo, aplicaron el método de la peroxidasa en pH neutro y alcalino, habiendo verificado diferencia de reacción entre heterófilos y eosinófilos. En el segundo trabajo, utilizando las técnicas para la detección de la trimetafosfatasa, de la fosfatasa alcalina y de la esterasa no específica, verificaron también la posibilidad diferenciar estos dos tipos de granulocitos.

PELLIZON (1996) estudió el comportamiento de los trombocitos de las tortugas Phrynopys hilari y Chrisemys dorbignih, utilizando técnicas citoquímicas y ultraestructurales para demostrar la participación de esas células en procesos endocíticos.

Finalmente, nosotros en un trabajo previo (MOURA, 1996), estudiamos aspectos morfológicos y citoquímicos en las células de la sangre de Caiman crocodilus yacare.

En base a lo expuesto, decidimos realizar investigaciones sobre algunos aspectos ultraestructurales de células sanguíneas del reptil arriba referido.

MATERIAL Y METODO

Fueron utilizados diez ejemplares jóvenes, del caimán de la espécie Caiman crocodilus yacare (Reptilia, Crocodilia), conocido vulgarmente por el nombre de "yacaré del pantanal". Para la realización del análisis ultraestructural fueron tomadas muestras de sangre periférica por punción del seno venoso cervical, haciéndose la inmediata transferencia para tubos de ensayo con anticoagulante EDTA (ácido etilenodiamino tetracético). Fueron tomados 5ml de sangre de cada animal, los que fueron centrifugados y procesados para análisis ultraestructural.

Las muestras de sangre fueron colocadas en tubos de centrífuga y sometidas a 2.000 rpm para obtener la parte leucocitaria (ANDERSON, 1965), que fue inmediatamente fijada en Karnovsky modificado (KARNOVSKY, 1965), siguiendo con fijación en tetróxido de osmio, deshidratación, inclusión, obtención de cortes finos y coloración (RICHARDSON et al., 1960). Contrastación de los cortes ultrafinos con solución de acetato de uranilo (WATSON, 1958), en solución de citrato de plomo (REYNOLDS, 1963) y, finalmente, observación al microscopio electrónico Carl Zeiss EM 900, 80kV.

RESULTADOS

El trombocito, cuando es observado en corte longitudinal, predominantemente presenta la forma elíptica y el volumen citoplasmático variable, siendo generalmente más abundante en los polos, donde se observa una área poco electrodensa y de aspecto homogéneo. Principalmente en la región perinuclear y alrededor del núcleo, se observa gran cantidad de túbulos y vesículas electrolúcidas del sistema canalicular. Se observan también vacuolas con gránulos densos, microtúbulos, pocas mitocondrias, retículo endoplasmático granular, ribosomas y vesículas de pinocitosis. El núcleo se caracteriza por ser elíptico, cuando es observado a lo largo de su eje mayor, presentando hendiduras, que se tornan más nítidas en cortes transversales u oblicuos (Fig. 1). La heterocromatina, de más intensa electrodensidad, se condensa en la superficie interna de la envoltura nuclear, circundando áreas de eucromatina localizadas centralmente. Es evidente la presencia de poros nucleares.

El eosinófilo presenta forma aproximadamente esférica u ovalada, exhibiendo prolongaciones citoplasmáticas cortas y delgadas. El citoplasma es abundante, rico en mitocondrias y gránulos citoplasmáticos voluminosos con electrodensidad moderada o intensa, de formas esférica y oval, en general ocupando todo el citoplasma. Algunos gránulos, sin embargo, presentan una estructura interna heterogénea constituida por material finamente granuloso. Escasos trazos de retículo endoplasmático y ribosomas libres están presentes. Son evidentes algunas vesículas pequeñas, con o sin cuerpos densos. El núcleo ocupa una posición excéntrica, presentando forma redondeada y heterocromatina distribuida periféricamente, circundando la región eucromática. Es posible observar un nucléolo y varios poros nucleares (Fig. 2).

El heterófilo presenta forma aproximadamente esférica, con contorno irregular y prolongaciones citoplas-máticas. El citoplasma es abundante, conteniendo gran cantidad de gránulos citoplasmáticos de tamaño y eletrodensidad variables, mostrando formas esférica, oval, elíptica, en bastón e irregular. Algunos gránulos muestran contorno no regular. Se observan numerosas vesículas electrolúcidas, con aspecto de vesículas de endocitosis en diferentes estadios de ese proceso, pocas mitocondrias, retículo endoplasmático y ribosomas. En algunas regiones aparecen estructuras que se asemejan a formaciones fibrilares. El núcleo excéntrico, muestra cromatina tanto eucromática al centro como heterocromática, adherida a la membrana de la envoltura nuclear. Es evidente la presencia de un nucléolo de eletrodensidad menos intensa. Se observan poros en la membrana nuclear (Fig. 3).

La preferencia de la especie Caiman crocodilus yacare para la investigación en este trabajo fue motivada por el hecho de que este animal es de creciente interés económico y, al mismo tiempo, científico, y por la escasez de datos en la literatura específica. No ha sido encontrada, por ejemplo, ninguna referencia relativa al estudio de los aspectos morfológicos, citoquímicos o ultraestructurales de células sanguíneas en esta especie de reptil. Además, el conocimiento sobre tales aspectos y de los demás datos hematológicos, es de fundamental importancia como contribución a los clínicos veterinarios que se dedican a la asistencia de esos animales en criadeos comerciales y/o en otras condiciones de cautiverio.

En nuestro estudio previo, a través de microscopía electrónica (MOURA et al., 1997), los trombocitos de Caiman crocodilus yacare presentaron núcleo con hendidura acentuada, predominancia de heterocromatina y, en el citoplasma, mitocondrias de matriz densa, microtúbulos extensos, vesículas de pinocitosis y retículo endoplasmático discreto. Estos resultados coinciden con los de MAXWEL & TREJO para aves domésticas. Figuras de mielina también fueron observadas en trombocitos, concordando con los resultados de STOKES & FIRKIN para Heterodontus portusjacksonii. El núcleo de los trombocitos presentó surcos, tal como los descritos por FERGUSON para Pleuronectes platessa. Observaciones semejantes fueron relatadas también por DAIMON & UCHIDApara Gallus domesticus, utilizando rojo de Rutenio para evidenciar mejor el sistema canalicular, conforme fue relatado posteriormente también por DAIMON et al. (1979) para Rana nigro-maculata.

El eosinófilo de Caiman crocodilus yacare presentó forma esférica y pseudópodos poco desarrollados, o sea, cortos y delgados. El núcleo mostró tanto hetero-cromatina como eucromatina y nucléolo. El citoplasma contenía gránulos de formato redondeado u oval, mitocondrias y muchas vesículas electrolúcidas, algunas con cuerpos densos. Estos resultados confirman aquellos obtenidos por MAXWELL & TREJO, para aves domésticas. Resultados semejantes fueron obtenidos también por BIELEK (1981) para tres especies de peces teleósteos, PAGE & ROWLEY para Lampetra fluviatilis, DOGGET & HARRIS para Oreochromis mossambicus y AZEVEDO & LUNARDI para Chrysemis dorbignih. El granulocito de tipo eosinófilo del reptil Caiman crocodilus yacare no presenta, en los gránulos específicos, la estructura cristalina típica, característica encontrada en mamíferos. Con respecto a las características ultraestructurales de la célula como un todo, particularmente de las prolongaciones citoplas-máticas y de los gránulos, nuestros hallazgos en Caiman crocodilus yacare coinciden con los resultados descritos por MAXWELL & TREJO para los eosinófilos de aves domésticas, cuyas diferencias consisten solamente al padrón de distribución irregular de los gránulos y a la presencia de material flocular en algunos de ellos. La apariencia homogénea en algunos gránulos y finamente granular en los esféricos grandes, es descrita por DOGGET & HARRIS para el granulocito tipo 2 de O. mossambicus y por BIELEK para el eosinófilo de tres especies de peces, tal como en el eosinófilo del reptil en estudio.

Los heterófilos de Caiman crocodilus yacare presentaron forma esférica, con expansiones citoplas-máticas, núcleo con heterocromatina y eucromatina, nucléolo, citoplasma conteniendo pocas mitocondrias pequeñas, gránulos citoplasmáticos heterogéneos con respecto al tamaño, eletrodensidad y forma, pudiendo ser en bastón, fusiformes, esféricos u ovales, confirmando los relatos de MAXWEL & TREJO para aves domésticas, FERGUSON para Pleuronectes platessa, ZAPATA et al. (1981) para Lacerta hispanica, BIELEK para tres especies de peces y PAGE & ROWLEY para Lampetra fluviatilis, quienes encontraron también aspectos semejantes en relación a los hallazgos ultraestructurales en este tipo de granulocito. AZEVEDO & LUNARDI, estudiando Chrysemis dorbignih, presentaron resultados compatibles con los nuestros, principalmente en lo que se refiere a los gránulos citoplasmáticos, después de la aplicación de citoquímica electrónica.

Con respecto a la función, considerando la semejanza en los aspectos ultraestructurales, es posible admitir que los trombocitos, eosinófilos y heterófilos de Caiman crocodilus yacare puedan ejercer actividad fagocítica. Para comprobar "in vitro" tales características funcionales MATEO et al. (1984) incubaron células sanguíneas de Alligator mississipiensis en la presencia de Staphylococcus aureus y observaron actividad fagocítica en trombocitos, heterófilos y eosinófilos, además de la actividad aglutinante de los trombocitos. Varios aspectos ultraestructurales de esas células, descritos anteriormente, también conducen, indudablemente, a creer en el desempeño de la función aquí propuesta para estas células. Además, nuestros resultados citoquímicos, constatando la presencia de diversos componentes citoplasmáticos (MOURA) son compatibles con el desempeño de tales funciones.

Finalmente, podemos concluir que Caiman crocodilus yacare presenta trombocitos elípticos, con citoplasma poco voluminoso, sistema canalicular bien desarrollado y presencia de vesículas con cuerpos densos y el núcleo, en general irregular, presenta surcos profundos. Los eosinófilos contienen en el citoplasma numerosos gránulos voluminosos, algunos con estructura interna heterogénea o granular, mitocondrias, y vesículas con o sin cuerpos densos. Los heterófilos presentan citoplasma con numerosas vesículas electrolúcidas y muchos gránulos heterogéneos. En heterófilos y eosinófilos el núcleo es excéntrico, con poros y nucléolo evidentes.

SUMMARY:Little information is available on the ultrastructural characteristics of the blood cells in reptiles. In the present study we have examined the fine structure of heterophils, eosinophils and thrombocytes from the blood of a crocodile (Caiman crocodilus yacare). Samples of peripheral blood from healthy young were collected with EDTA and centrifuged. The buff coat was collected and fixed in half strength Karnovsky solution. Spindl-eshaped thrombocytes showed large nuclei with prominent heterochromatin juxtaposed to the nuclear envelop. Cytoplasmic organelles were scarce: there were mitochondria, some profiles of roughsurface endoplasmic reticulum, free ribosomes and microtubules. Many tubular structures and vacuoles were distributed throughout the cytoplasm, forming the open canalicular membrane system. Heterophils and eosinphils revealed round eccentric nuclei with prominent nucleoli. The cytoplasm of heterophils contained many polymorphic granules with homogeneous electrondense matrix. Ribosomes, roug-surfaced endoplasmic reticulum and many clear vesicles were observed. Some fibrillar structures were also present. In addition to the usual organelles, the cytoplasm of eosinophils were essentially filled with many round or slightly oval granules with heterogeneous electron-dense matrix; in some of them a fine granular structure was visible. Both heterophils and eosinophils showed long numerous pseudopodia.

KEY WORDS: 1. Caiman crocodilus yacare; 2. Blood cells; 3. Ultrastructure

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

ANDERSON, D. R. A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy. J. Ultrastruct. Res., 13:263-8, 1965.

AZEVEDO, A. & LUNARDI, L.O. Cytochemical peroxidase detection in eosinophilic granulocytes in the blood of the turtle Chrysemis dorbignih. In: 3rd Interamerican conference on electron microscopy. XV meeting of the Brazilian Society for Electron Microscopy, Caxambú/Brazil, 1995. Acta Microsc., 4(A). Brasília, 1995. p.152.

BIELEK, E. Developmental stages and localization of peroxi-datic activity in the leucocytes of three teleost species (Cyprinus carpio L.; Tinca tinca L.; Salmo gairdneri Richardson). Cell Tissue Res., 220:163-80, 1981.

DAIMON, T. & UCHIDA, K. Electron microscopic and cytochemical observations on the membrane systems of the chicken thrombocyte. J. Anat., 125(1):11-21, 1978.

DAIMON, T.; GOTOH, Y. & UCHIDA, K. Electron microscopic and cytochemical studies of the thrombocytes of the tortoise (Geoclemys reevesi). J. Anat., 153:185-90, 1987.

DAIMON, T.; MIZUHIRA, V. & UCHIDA, K. Fine structural distribution of the surfaceconnected canalicular system in frog thrombocytes. Cell Tissue Res., 201:431-9, 1979.

DESSER, S. S. & WELLER, I. Ultrastructural observations on the erythrocytes and thrombocytes of the tuatara, Sphenodon punctatus (Gray). Tissue & Cell, 11(4):717-26, 1979.

DOGGETT, T. A. & HARRIS, J. E. Ultrastructure of the peripheral blood leucocytes of Oreochromis mossambicus. J. Fish Biol., 34:747-56, 1989.

FERGUSON, H.W. The ultrastructure of plaice (Pleuronectes platessa) leucocytes. J. Fish Biol., 8:139-42, 1976.

KARNOVSKY, M. J. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolalidade for use in electron microscopy. J. Cell Biol., 27:137-8, 1965.

KELÉNYI, G. & NEMETH, A. Comparative histochemistry and electron microscopy of the eosinophil leucocytes of vertebrates. I. A study of avian, reptile, amphibian and fish leucocytes. Acta Biol. Acad. Sci. Hung., 20(4):405-22, 1969.

LUNARDI, L.O. & AZEVEDO, A. Cytochemical characterization of eosinophilic leukocytes in the circulating blood of the turtle Chrysemys dorbignih. In: 3rd Interamerican conference on electron microscopy. XV meeting of the Brazilian Society for Electron Microscopy, Caxambu/Brazil, 1995. Acta Microsc., 4(A). Brasília, 1995. p.151.

MATEO, M. R.; ROBERTS, E. D. & ENRIGHT, F. M. Morphologic, cytochemical, and functional studies of peripheral blood cells of young healthy American alligators (Alligator mississippiensis). Am. J. Vet. Res., 45(5):1046-53, 1984.

MAXWELL, M. H. & TREJO, F. The ultrastructure of white blood cells and thrombocytes of the domestic fowl. Br. Vet. J., 126:583-92, 1970.

MOURA, W. L. Aspectos morfológicos e citoquímicos de células sanguíneas e ultraestruturais de trombócitos, heterófilos e eosinófilos do sangue periféricos de Caiman crocodilus yacare. São Paulo, 1996. [Tese Mestrado Universidade Federal de São Paulo].

MOURA, W. L.; OLIVEIRA, L. W.; MATUSHIMA, E. R. & EGAMI, M. I. Ultrastructural Observations of thrombocytes, heterophils and eosinophils in Caiman crocodilus yacare. In: I Encontro Nacional de PósGraduação em Áreas da Biologia Estrutural, Campinas/Brasil, 1997. Braz. J. morphol. Sci., 14(1). Brasilia, 1997. p.117.

PAGE, M. & ROWLEY, A. F. A cytochemical, light and electron microscopical study of the leucocytes of the adult river lamprey, Lampreta fluviatilis (L. Gray). J. Fish Biol., 22:503-17, 1983.

PELLIZZON, C.H. Participação de trombócitos de tartaruga em processos endocíticos. Uma análise ultraestrutural e citoquímica. Ribeirão Preto, 1996. [Dissertação Mestrado Universidade de São Paulo].

REYNOLDS, E.S. Use of lead citrate at hight pH as an electronopaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol., 17:208-13, 1963.

RICHARDSON, K.C.; JARETT, L & FINKE, E.H. Embedding in epoxy resins for ultrathin sectioning in electron microscopy. Stain Technol., 35:313-23, 1960.

STOKES, D. & FIRKIN, B.G. Studies of peripheral blood of the port jackson shark (Heterodontus portusjacksoni) with particular reference to the thrombocyte. Br. J. Haematol., 20:427-35, 1971.

WATSON, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. J. Biophys. Biochem. Cytol., 4:475-8, 1958.

ZAPATA, A.; LECETA, J. & VILLENA, A. Reptilian bone marrow: an ultrastructural study in the Spasnish lizard, Lacerta hispanica. J. Morphol., 168:137-49, 1981.

Dirección para correspondencia:
Prof. Dr. Weber Leal de Moura
Departamento de Morfologia Setor de Histologia
Universidade Federal de São Paulo - EPM
Rua Botucatu, 740 Vila Clementino
04023900 São Paulo SP
BRASIL

email: webermoura.dmed@epm.br
Telefax: 55 (011)5764271 55(011)5764268

Recibido : 08-10-1997
Aceptado: 10-11-1997