SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.17 número2ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE LA MASA OSEA EVALUADA POR PROTOCOLOS KINEANTROPOMETRICOS V/S DENSIDAD OSEA MEDIDA POR DENSITOMETRIA FOTONICA DUAL: COMPARATIVE STUDY AMONG KINANTHROPOMETRIC BONE MASS V/S DUAL FOTONIC BONE DENSITYIMPACTO DE DOS PROGRAMAS COMPUTACIONALES DE ANATOMIA HUMANA EN EL RENDIMIENTO DEL CONOCIMIENTO PRACTICO DE LOS ALUMNOS índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Revista

Articulo

Indicadores

Links relacionados

Compartir


Revista chilena de anatomía

versión impresa ISSN 0716-9868

Rev. chil. anat. v.17 n.2 Temuco  

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98681999000200011 

 EVIDENCIAS INMUNOCITOQUIMICAS SOBRE LA PRESENCIA DE LA SERPINA
CBG-símil EN EL SISTEMA REPRODUCTOR DE LA HEMBRA EN BOVINOS

IMMUNOCYTOCHEMISTRY EVIDENCE ON THE PRESENCE OF THE SERPINA
CBG-like IN THE REPRODUCTIVE SYSTEM OF THE FEMALE BOVINE

* Peña, P.
* Vásquez, B.
** Veuthey, C.
* Risopatrón, J.
* Sánchez, R.
*** Miska, W.

* Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.
** Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Católica de Temuco, Temuco, Chile.
*** Departamento de Dermatología y Andrología, JL-Universität Giessen, Alemania.
Financiado por DIUFRO 9735 y DFG-GTZ-93.2157.1-06.100.

 RESUMEN: La reacción acrosomal es un proceso esencial para la fecundación en mamíferos. Recientemente, ha sido demostrado que la globulina que une corticoides (CBG), asociada a progesterona, induce la reacción acrosómica en niveles fisiológicos, in vitro. En la búsqueda de un componente morfológico in situ, utilizando rastreo inmunocitoquímico, nuestro grupo ha demostrado su presencia en células secretoras de ciertas regiones del sistema reproductor femenino humano. Si esta molécula, a través de la reacción acrosomal, está involucrada en los mecanismos que llevan finalmente a la fecundación en humanos, parece razonable suponer que tiene una participación similar en otras especies mamíferas con procesos reproductivos básicamente comparables.

El objetivo del presente trabajo fue determinar, a través de la inmunocitoquímica (ICQ), la presencia y distribución de la CBG-símil en el sistema reproductor de bovinos hembras, en los distintos estadios del ciclo reproductivo. Muestras de ovarios, útero, tuba uterina y células epiteliales tubáricas en cultivo fueron procesadas para la ICQ. Para ello, se utilizaron anticuerpos policlonales contra CBG humana (comercial y otro producido en nuestro laboratorio) capaz de reconocer determinantes antigénicos comunes. La ICQ demostró, a nivel ovárico una reacción positiva preferentemente en células de folículos en estadios superiores de desarrollo. A nivel de la tuba uterina la inmunotinción se presentó claramente en células no ciliadas del epitelio tubárico. En el endometrio la reacción se concentró en las células epiteliales de las glándulas endometriales, sin observarse inmunorreacción a nivel estromal. La inmunotinción fue muy intensa en los períodos de mayor actividad estrogénica para, prácticamente, desaparecer en vacas sin actividad o en vacas preñadas. Las células de cultivo oviductales revelaron una población con reacción intensamente positiva y otra claramente negativa. Nuestros resultados nos permiten sugerir que en el bovino existe la presencia de CBG-símil, la cual se distribuye en áreas morfológicas similares a las observadas en humano, y su concentración depende del ciclo ovárico. Tales elementos permitirían sugerir que esta particular molécula juega un rol similar en la especie bovina.

PALABRAS CLAVE: 1. CBG; 2. Bovinos; 3. Inmunocitoquímica; 4. Cultivos celulares; 5. Ovarios; 6. Utero; 7. Tuba uterina.

INTRODUCCION

Importantes funciones espermáticas como la capacitación, reacción acrosomal, unión a la zona pelúcida y fusión con el oolema, son moduladas por el tracto genital femenino. Dentro de los complejos mecanismos que conducen a la fecundación en las especies mamíferas, la reacción acrosomal que permite la liberación al medio de las enzimas acrosomales, se constituye en un proceso previo esencial (FLORMAN & STOREY, 1982; YANAGIMACHI & PHILIPS, 1984; MEIZEL et al., 1990). En 1994, MISKA et al., trabajando con líquido folicular de humanos, aislaron una globulina con todas las características de CBG-símil. La CBG (Corticosteroid binding globuline) es miembro de la superfamilia de las serpinas, pero pertenece a un grupo de proteínas que durante el curso de la evolución, perdió la capacidad sérica de inhibir proteinasas y derivó hacia el transporte de esteroides. Ensayos in vitro, demostraron que esta molécula, unida con progesterona y en concentraciones fisiológicas, induce la reacción acrosomal en espermatozoides humanos (BALTES et al., 1995; SÁNCHEZ et al., 1997). Posteriormente, PEÑA et al. (1996) y BALTES et al. (1998), han aportado evidencias morfológicas que demuestran su presencia, con probables sitios de síntesis y secreción, en tuba uterina, endometrio y ovario humanos. Estas evidencias situarían al complejo CBG-símil-progesterona como parte de un mecanismo esencial en los eventos que llevan finalmente a la fecundación en la especie humana. El entendimiento de éstos complejos procesos regulatorios no sólo es importante desde el punto de vista del estudio de sus mecanismos de acción sino que, además, su dilucidación contribuye decisivamente al éxito en los pasos preparativos de la fecundación in vivo e in vitro. Si ello ocurre en el hombre, entonces, parece razonable suponer que esta molécula presenta una acción similar en otras especies mamíferas, en que sus procesos reproductivos son básicamente comparables y en los cuales la optimización de los procedimientos previos a la fecundación in vitro, tienen particular relevancia por tratarse de especies de beneficio para el hombre.

El objetivo de este estudio fue determinar mediante inmunocitoquímica (ICQ), la probable presencia de CBG en los sistemas reproductores de bovinos hembras y su variación en estadios de su ciclo reproductivo. La detección ICQ se realizó tanto en tejidos como en células aisladas del epitelio tubárico, y mantenidas en cultivos in vitro.

MATERIAL Y METODO

Obtención cultivo de células epiteliales oviductales: El procedimiento utilizado para el aislamiento celular, y su posterior cultivo, fue el descrito por GUÉRIN et al. (1995). Los oviductos de bovino fueron colectados, desde un matadero local, con solución salina (Na Cl 0.85%), suplementada con antibiótico (100 UI/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina). Para la disociación celular los oviductos fueron lavados internamente, con una solución de tripsina al 0.25% (Sigma) en TCM-199 Hepes buffer (Sigma), suplementado con solución antibiótica. La acción de la tripsina se neutralizó adicionando suero fetal de bovino (1:1 v/v). Luego de la centrifugación (600 g por 10 min) el pellet se resuspendió en 1 ml de suero fetal de bovino (Sigma) y se colocó en una gradiente discontinua de Percoll (10, 30, 50%), en medio TCM-199. Las células recuperadas fueron cultivadas en medio TCM-199 suplementado y fueron incubadas a 38ºC, 5% CO2 y 100% de humedad, por 5 días. Posteriormente, las células fueron recuperadas y centrifugadas para la obtención de un pellet.

Muestras de tejidos: Las muestras de útero, tuba uterina y ovario, de animales en diferentes estadios del ciclo reproductivo, fueron obtenidas desde un matadero local e, inmediatamente, fijadas en Methacarn, fijador tipo Carnoy, (PEÑA et al., 1996). La inclusión se hizo en paraplast. Las muestras provenientes de los cultivos celulares fueron fijadas en Methacarn, en frío (4ºC), por 20 minutos. Luego de la centrifugación, el pellet formado se incluyó en agarosa (1.5%). Este trozo de agarosa se fijó nuevamente por 10 minutos, en las mismas condiciones anteriores y, posteriormente, se procedió a la deshidratación y al proceso de inclusión en paraplast. De cada muestra se realizaron cortes seriados de 5-7 µm, los cuales se montaron en portaobjetos con poly-l-lysina (Sigma P-1524). El estudio morfológico (con hematoxilina-eosina y la ICQ) y las fotografías se realizaron con un microscopio Carl Zeiss, Axiolab, c/cámara MC 80 DX. La ICQ se realizó por el método del PAP, según técnica del segundo anticuerpo (STERNBERGER et al., 1970). El anticuerpo específico fue un policlonal (-) hCBG, obtenido en conejo (Biogenesis Inc, USA; y de propia producción), 2º Ac: Dako Z0196 y PAP conejo: Dako, Z0113. El revelado de la inmunotinción se realizó con 3,3'- diaminobenzidina (Sigma, D-5637), en presencia de H2O2 (Merck 1.07210). Los controles negativos fueron realizados en cortes seriados, vecinos a los inmunopositivos, por incubación con sueros de conejos no inmunes. Los controles positivos se realizaron utilizando hígados humano y bovino, en los cuales se rastreó con anticuerpos mono y policlonales anti hCBG. Una vez finalizada la reacción, los preparados fueron teñidos con hematoxilina, por 10-30 segundos, como tinción de contraste nuclear. El montaje se realizó con Permount (Fisher, USA).

RESULTADOS

Los análisis morfológicos e inmunocitoquímicos mostraron los siguientes resultados:

A nivel ovárico, se observó una intensa y selectiva reacción inmunopositiva en células foliculares, material floculado del fluido folicular y en células de la teca interna de los folículos ováricos, lo cual contrasta nítidamente con los controles(*) (Fig. 1). La inmunotinción se observó desde pequeños folículos y se hizo más intensa en aquellos con mayor grado de maduración, para ser muy intensa, en los folículos maduros. Asimismo, células con citoplasmas granulosos e intensamente positivos para la CBGir fueron encontradas, sistemáticamente, en los animales con actividad ovárica cíclica, en forma aislada o en pequeños grupos, pero siempre diseminadas por el estroma ovárico y sin presentar alguna asociación a elementos foliculares (Fig. 2).



Fig. 1. Inmunocitoquímica contra CBG en folículos ováricos de bovinos. Intensa inmunorreacción en células de la granulosa y en ciertas de la teca interna. Inserción: tejido adyacente control inmunocitoquímico negativo. (630X).



Fig. 2. Inmunocitoquímica contra CBG en tuba uterina de bovinos. A) Intensa inmunorreacción en ciertas células del epitelio tubárico. B) Control inmunocitoquímico negativo en tejido adyacente. (630X).

El epitelio de revestimiento de la tuba uterina, morfológicamente, consta de dos tipos celulares, que por sus características citológicas clásicamente han sido descritas como una población de células ciliadas y otra de células secretoras. Las diferenciaciones apicales de las ciliadas hace que constituyan una población celular de fácil diferenciación, incluso, con tinciones corrientes (H-E). La ICQ para la CBG, reveló que, específicamente, las células secretoras del epitelio oviductal se tiñeron muy fuertemente, en particular el citoplasma apical, variando claramente su intensidad según la etapa del ciclo estral en que se encontraba el animal (Fig. 3), para prácticamente desaparecer en vacas sin actividad, o en vacas preñadas. A nivel endometrial, se observó también intensa inmunorreacción en ciertas células de la mucosa endometrial y en células de las glándulas endometriales. Esta reacción se mostró claramente más intensa en endometrios con glándulas que presentaban mayor desarrollo (Fig. 4).



Fig. 3. Inmunocitoquímica contra CBG en mucosa (A y B) y glándulas endometriales (C y D) en bovinos. Intensa inmunorreacción en ciertas células del epitelio de la mucosa endometrial (A) y en glándulas endometriales (C). B) y D) control inmunocitoquímico negativo en tejido adyacente [(A) y C) 630X; B) y D) 400X].

 



Fig. 4. Inmunocitoquímica contra CBG en células oviductales cultivadas. a) y b) células inmunopositivas. c) Control inmunocitoquímico negativo. (630X).

 

Los cultivos de células obtenidas del epitelio oviductal presentaron - al igual que el epitelio tubárico intacto - dos poblaciones citológicamente diferentes, una población ciliada, claramente diferenciables por la presencia morfológica de cilios y por la intensa actividad de movimiento que éstos presentaron en el cultivo, y otra importante población carente de cilios. Ambas poblaciones estaban entremezcladas en los cultivos y, por tanto, fueron siempre procesadas simultáneamente. Al realizar la ICQ en los pellets, el resultado nos reveló la presencia de las dos poblaciones, mientras que una de ellas presentó intensa inmunorreacción positiva en todo su citoplasma, la otra, resultó ser claramente negativa y teñida sólo muy tenuemente por la tinción de contraste (Fig. 5 a y b).

(*) En todos los casos se realizaron los correspondientes controles con cortes vecinos, que se procesaron simultáneamente, en vez de suero inmune (con el anticuerpo específico, ó primer anticuerpo), con suero no inmune (sin primer anticuerpo).

DISCUSION

MISKA et al., aislaron una globulina (serpina CBG-símil) desde el fluido folicular de humanos que, asociada a progesterona, induce reacción de acrosoma en niveles fisiológicos. Nuestro grupo, utilizando rastreo inmuno-citoquímico, ha aportado importantes evidencias para demostrar su presencia en el sistema reproductor femenino humano (PEÑA et al., 1996; BALTES et al., 1998). Estas evidencias sugieren fuertemente que la molécula de CBG podría estar involucrada en los mecanismos que llevan, finalmente, a la fecundación en la especie humana. De ser así, posiblemente esta molécula podría jugar una acción similar, en otras especies mamíferas con fenómenos reproductivos básicamente comparables.

Utilizamos a la especie bovina, especialmente por la facilidad en la obtención de muestras de tejido, por su fácil desarrollo de los cultivos celulares in vitro y por la importancia del manejo reproductivo a gran escala. Sin embargo, y dado que no existen evidencias directas respecto de la presencia de la molécula de CBG-símil, específicamente en el sistema reproductor de hembras de bovinos, su rastreo sólo fue posible utilizando un anticuerpo policlonal comercial (y otro de propia producción), realizado contra CBG humana pura (PEÑA et al., 1998). La CBG-símil humana es una molécula proteica (globina) de gran tamaño, del tipo de las serin-proteinasas y que, desde el punto de vista inmunológico, su estructura presenta un sinnúmero de determinantes antigénicos, los que al ser utilizados para inducir respuesta inmune humoral, generan la producción de familias de anticuerpos (anticuerpos policlonales), cuyas especificidades podrían presentar reacción cruzada con estructuras moleculares de naturaleza estrechamente relacionadas. Este fundamento apoya nuestros resultados, en que si bien es un anticuerpo relacionado por la reactividad cruzada, tanto los sitios de reacción como la intensidad de las marcas son similares a los resultados obtenidos en la especie humana con anticuerpos poli y monoclonales, y por tanto, se constituye en una buena aproximación al rastreo de esta molécula en otras especie mamíferas.

A nivel ovárico se observaron células foliculares como de la teca interna, intensamente teñidas, revelando además una clara diferencia en la intensidad de reacción, la que dependió de la etapa del ciclo en la cual se encontraba el animal (gestación o actividad). Llama la atención la constante presencia de células estromales inmunrreactivas distribuidas, en baja proporción, en el estroma del órgano y cuyo significado es aún desconocido. En la tuba uterina, la ICQ reveló la presencia de intensa inmunorreacción específicamente en células secretoras del epitelio tubular, concentrándose la tinción en gránulos del citoplasma apical. Resultados similares se obtuvieron con preparados de útero provenientes de animales con ciclo ovárico activo, en que se tiñeron muy intensamente los citoplasmas apicales de ciertas células del epitelio del endometrio, coincidiendo con los estadios fisiológicos en que el epitelio era más alto y, por ende, con mayor tamaño citoplasmático. En endometrios que correspondieron al final de la fase estrogénica, se comenzó a visualizar también inmunotinción en las glándulas endometriales. Esto contrasta notablemente con aquellos provenientes de animales que estaban en gestación. Los resultados obtenidos en cortes de la tuba uterina se correlacionan con los obtenidos en las células aisladas procedentes de cultivos de células del epitelio tubárico. En los cultivos se distinguieron también dos tipos celulares (las secretoras y las ciliadas), dando intensa inmunorreacción sólo el tipo secretor. Estas células no presentaron grandes variaciones en su contenido secretor debido a que mientras se mantuvieron en cultivo no existieron suplementaciones hormonales. Las variaciones cuantitativas y cualitativas en la secreción de gránulos de las células secretora epiteliales observadas en tejidos, durante las diferentes etapas del ciclo reproductivo, proveerían al oviducto - a través del fluido tubárico - un ambiente apropiado para la función de los gametos (HAFEZ , 1987; PARRISH, et al., 1989; CHIAN & SIRAD, 1995; BALTES, et al., 1998). En este sentido, nuestros resultados sugieren consistentemente también la participación del sistema CBG-símil en el proceso de fecundación en bovinos y, al igual que en los humanos, su función podría estar relacionada en los mecanismos que desencadenan la reacción acrosomal previo a la fecundación. 

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Sr. Jorge Seguel V. del Laboratorio de Técnicas Histológicas del Depto. de Ciencias Básicas de la Universidad de La Frontera, por su valiosa asistencia técnica.

 SUMMARY: The acrosoma reaction is an essential process for fertilization in mammals. Recently it has been demonstrated that the globulin that binds corticoids (CBG), associated to progesterone, induces the acrosomal reaction at physiologic levels in vitro. In the search of a morphologic component in situ, our group, using immunocytochemistry as screening test, has demonstrated its presence in secretory cells of certain regions of the female reproductive system in humans. If this molecule, through the acrosomal reaction, is involved in the mechanisms that leads to fertilization in humans, it seems reasonable to suppose a similar participation in other mammal species with basically comparable reproductive processes.

The objective of the present work was to determine immunocytochemically (ICQ) the presence and distribution of the CBG-like protein in the reproductive system of bovine females in the different stages of the reproductive cycle. Samples of ovaries, uterus, uterine tube and cultured uterine tubeal epithelial cells were processed for the ICQ. In order to accomplished this, polyclonal antibodies against human CBG (commercial and another produced in our laboratory) able to recognize common antigenic determinants. The ICQ demonstrated a positive reaction at ovarian level mainly in cells of follicles at higher developmental stages. At the level of uterine tube, the immunostaining was presented clearly in non-ciliated cells of the uterine tube epithelium. In the endometrium, the reaction concentrated on the epithelial cells of the endometrial glands, without observing immunoreaction at estromal level. The immunostaining was very intense in the periods of more estrogenic activity, to practically disappear in cows without activity or in pregnant cows. The cultured uterine tubeal cells revealed a population with intensely positive reaction and another one being clearly negative. Our results allow us to suggest that in the bovine the presence of CBG-like protein exists, which is distributed in similar morphologic areas observed in humans, and its concentration depends on the ovarian cycle. Elements that would allow to suggest that this molecule plays a similar role.

KEY WORDS: 1. CBG; 2. Bovine; 3. Immunocytochemistry; 4. Celular culture; 5. Ovary; 6. Uterus; 7. Uterine tube.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

BALTES, P.; SÁNCHEZ, R.; SCHLLES, U. K.; VILLEGAS, J.; PEÑA, P.; HENKEL, R.; TURLEY, H. & MISKA, W. Origin and nature of the acrosome reaction-inducing substance (ARIS) of human follicular fluid (hFF). Human sperm acrosome reaction. Eds P. Fénichel, J. Parinaud. Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd 1995, Vol. 236, pp. 400-401.

BALTES, P.; SÁNCHEZ, R.; PEÑA, P.; VILLEGAS, J.; TURLEY, H. & MISKA, W. Evidence for the synthesis and secretion of a CBG-like serpin by human cummulus oophorus and fallopian tubes. Andrologia, 30:249-53, 1998.

CHIAN, R. C. & SIRARD, M. A. The fertilizing ability of bovine spermatozoa cocultured with oviduct epithelial cells. Biol. Reprod., 52:156-62, 1995.

 FLORMAN, H. M. & STOREY, B.T. Mouse gamete interactions: The zona pellucida is the site of the acrosome reaction leading to fertilization in vitro. Dev. Biol., 91:121-30, 1982.

GUÉRIN, P.; GUILLAUD, J. & MÉNÉZO, Y. Hipotaurine in spermatozoa and genital secretions and its production by oviduct epithelial cells in vitro. Human Reproduction, 10(4): 866-72, 1995.

HAFEZ, E. S. E. Reproducción e inseminación artificial en animales. 5° ed. Interamericana, 1987.

MEIZEL, S.; PILLAI, M. C.; DIAZ-PEREZ, E. & THOMAS, P. Initiation of the human sperm acrosome reaction by components of human follicular fluid and cummulus secretions including steroids. In: Fertilization in Mammals. Bavister BD, Cummins J, Roldan, ERS (eds) Norwell Mass., Serono Symposia, USA, pp 205-222, 1990.

MISKA, W.; FEHL, P. & HENKEL, R. Biochemical and inmunological characterization of the acrosome reaction - inducing substance (ARIS) of hFF. Biochem. Biophys. Res. Commun, 199(1):125- 9, 1994.

PARRISH, J. J.; SUSKO-PARRISH, J. L.; HANDROW, R. R.; SMITH, M. M. & FIRST, N. L. Capacitation of bovine spermatozoa by oviduct fluid. Biol. Reprod., 40:1020-5,1989.

PEÑA, P.; URETA, L.; IRRIBARRA, V.; SORUCO, M.; RISOPATRÓN, J.; SÁNCHEZ, R. & MISKA, W. Localización Immunocitoquímica de la serpina humana CBGir en tuba uterina de mujeres en diferentes estadios reproductivos. XVII Congreso Chileno de Anatomía, Universidad de Concepción. 7 al 9 de Noviembre, R:72, 1996.

PEÑA, P.; RISOPATRÓN, J.; SÁNCHEZ, R.; MISKA, W.; VEUTHEY, C.; SCHENKE, C. & VÁSQUEZ, B. Estudio Inmunocitoquímico sobre la presencia de la serpina CBG-símil en el sistema reproductor de mamíferos hembras. En: Proceedings IX Reunión anual de la Sociedad Chilena de Reproducción y Desarrollo R-75,1998, La Serena, Chile.

SÁNCHEZ, R.; BALTERS, P.; RISOPATRÓN, J.; VILLEGAS, J.; PEÑA, P.; SCHILL, W. B. & MISKA W. "CBG like SERPIN in human fallopian tubes: Possible role in induction of the acrosome reaction. Int. J. Androl., 20 (Suppl.)1:R-49, 1997.

STEMBERGER, L. A.; HARDY, P.H.; CUCULIS, J. J. & MEYER, H. G. The unlabeled antobody enzyme method of immunohistochemistry. Preparation and properties of soluble antigen-antibody complex (horseradish peroxidase-antihorseradish peroxidase) and its use in identification of spirochetes. J. Histochem. Cytochem., 18 :315-33 , 1970.

YANAGIMACHI, R. & PHILIPS, D.M. The status of acrosomal caps of hamster spermatozoa immediately before fertilization in vivo. Gamete Res., 9:1-19, 1984.

Dirección para correspondencia:
Sr. Prof. Patricio Peña S.
Unidad de Histología
Facultad de Medicina
Casilla 54-D
Temuco - CHILE
Email: ppena@ufro.cl

Recibido : 16-08-1999
Aceptado: 08-10-1999

Creative Commons License Todo el contenido de esta revista, excepto dónde está identificado, está bajo una Licencia Creative Commons