FETAL SEX DIFFERENTIATION: FROM MOLECULES TO ANATOMY

Prof. Dr. Rodolfo Rey. Centro de Investigaciones Endocrinológicas. Hospital de Niños "R. Gutiérrez", Buenos Aires,
Argentina y Cátedra de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética Facultad de Medicina, Universidad de
Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina

RESUMEN:El sexo del embrión queda determinado en el momento de la fecundación según que el espermatozoide contenga un cromosoma X o un cromosoma Y. Sin embargo, transcurren varias semanas durante la embriogénesis humana sin que existan diferencias evidentes -aún al microscopio electrónico- entre un feto de sexo femenino y uno de sexo masculino. A partir de la expresión del gen SRY en los fetos XY, las futuras gónadas inician una serie de eventos caracterizados por expresión de proteínas, que determinan cambios citológicos, histológicos y funcionales característicos de los testículos. Este evento relativamente temprano en el desarrollo del sexo se denomina determinación sexual, dada su importancia determinante en el resto de los eventos que se suceden luego. Los testículos secretan dos hormonas, hormona ani-Mülleriana y testosterona, cuya acción provoca la masculinización de los esbozos de los órganos genitales internos y externos, que no mostraban hasta entonces diferencias entre los sexos. El proceso de diferenciación de los genitales se denomina diferenciación sexual fetal. Poco se conoce hasta hoy sobre los mecanismos que inducen a las gónadas a tomar el camino ovárico en el feto XX. Es sabido desde hace tiempo, en cambio, que la falta de las hormonas testiculares resulta en la feminización de los genitales internos y externos, independientemente de la existencia o ausencia de ovarios. El conocimiento de los mecanismos moleculares, celulares y endocrinos involucrados en el desarrollo sexual fetal permiten comprender mejor la patología resultante de sus respectivas alteraciones que generan cuadros clínicos conocidos como ambigüedades sexuales.

PALABRAS CLAVE: 1. Ovario; 2. Testículo; 3. Genitales; 4. Determinación sexual; 5. Diferenciación sexual; 6. Feto; 7. Embrión; 8. Microscopía, Electrónica, óptica; 9. Morfogénesis.

El proceso de diferenciación de los órganos genitales en sentido masculino o femenino durante la vida embrionaria y fetal involucra una cadena de eventos moleculares, hormonales y no hormonales que se inician en el momento mismo de la formación del huevo o cigoto y se prolongan hasta etapas avanzadas de la vida intrauterina. Veremos aquí la evolución morfológica de los esbozos gonadales y genitales en embriones y fetos de ambos sexos, así como los mecanismos hormonales y no hormonales que explican dicha evolución.

ANATOMÍA E HISTOLOGÍA DE LA DIFERENCIACIÓN SEXUAL EMBRIO-FETAL

PERÍODO INDIFERENCIADO DEL DESARROLLO SEXUAL

Si bien el sexo del embrión queda determinado en el momento de la unión del óvulo materno con el espermatozoide paterno, existe un período de aproximadamente 5 semanas en el humano (o sea hasta 7 semanas después de la fecha de última menstruación de la madre), y de alrededor de 11 días en el ratón, durante el cual es imposible distinguir un individuo de sexo masculino de uno de sexo femenino por sus características anatómicas o histológicas. Esta etapa del desarrollo en la cual, aún bajo el examen con un microscopio electrónico, no hay diferencias entre individuos de uno y otro sexo se denomina período indiferenciado del desarrollo sexual.

Los aparatos urinario y genital se desarrollan a partir de los gononefrotomos, estructuras pares que se forman en el mesodermo intermedio, a ambos lados de la línea media. El origen común de ambos aparatos explica la existencia de alteraciones que comprometen en algunos casos tanto al desarrollo sexual como al del sistema urinario. Del gononefrotomo, sólo el mesonefros interviene en el desarrollo de estructuras del sistema genital. El mesodermo, recubierto por el epitelio celómico, hace protrusión en la cavidad celómica del embrión formando las crestas urogenitales, que ulteriormente se dividen en crestas gonadales, medialmente, y crestas urinarias, lateralmente. Durante el período indiferenciado, las crestas gonadales de ambos sexos están constituidas por células mesenquimáticas, revestidas por epitelio celómico. Estos esbozos de las futuras gónadas son bipotenciales, es decir que podrán evolucionar hacia testículos o hacia ovarios según la constitución genética del individuo, dando origen a los componentes somáticos de las gónadas. Las células germinales se originan en tejidos extraembrionarios, en el saco vitelino, migrando entre la 5ª y 6ª semanas hacia las crestas gonadales.

En el mesonefros, existe además una estructura tubular que corre en sentido longitudinal al eje mayor del gononefrotomo: el conducto mesonéfrico de Wolff. Una invaginación del epitelio celómico sobre el borde lateral de cada cresta gonadal da origen al conducto paramesonéfrico de Müller, que queda incluido en el mesodermo mesonéfrico. Estos dos pares de conductos constituyen los esbozos de los genitales internos (Fig. 1); a diferencia de los esbozos gonadales, los conductos de Wolff y de Müller son unipo-tenciales, como veremos más adelante.

Los órganos genitales externos se originan a partir de derivados de la cloaca y la membrana cloacal. El tabique uro-rectal divide a la cloaca en dos compartimientos: el seno urogenital, ventralmente, y el recto, dorsalmente. La membrana cloacal queda entonces dividida en membrana urogenital, por delante, y membrana anal, por detrás. El seno urogenital interviene en la formación de la vejiga y de la uretra, de la vagina y de la próstata. La membrana urogenital evoluciona formando los pliegues urogenitales, bordeados externamente por los repliegues labioescrotales; en el extremo anterior de los mismos se forma una estructura medial impar: el tubérculo (Fig. 2). Los esbozos de los genitales externos son bipotenciales; su evolución en sentido masculino o femenino depende respectivamente de la presencia o ausencia de hormonas testiculares.

DIFERENCIACIÓN SEXUAL DE LOS ESBOZOS DE LAS GÓNADAS Y DE LOS GENITALES

A fines de la 7ª semana del desarrollo (considerada a partir de la fecha de última menstruación), en el individuo XY las crestas gonadales se diferencian formando los testículos fetales. Es posible observar la formación de cordones testiculares, futuros tubos seminíferos, formados por una población de células somáticas, las células de Sertoli, y una población de células germinales, origen de las futuras gametas. Algunos días más tarde comienzan a diferenciarse en el intersticio entre los cordones seminíferos las células de Leydig. La población de células germinales está formada por los gonocitos, que se multiplican y se diferencian a espermatogonias; éstas también de dividen por mitosis, pero no entran en meiosis hasta la pubertad.

Las gónadas de los fetos XX permanecen con un aspecto indiferenciado más tiempo. Las células germinales primitivas dan origen a las ovogonias, que proliferan por mitosis hasta el 4^to mes. Algunas ovogonias situadas profundamente en el ovario fetal ingresan en meiosis a partir de la 13ª. semana, formando los ovocitos primarios, que se rodean de las células somáticas del ovario, las células foliculares, que darán origen a las células de la granulosa. Los ovocitos, rodeados de una capa de células foliculares planas, conforman los folículos primordiales; las células foliculares se hacen cúbicas y aumentan en número, conformando los folículos primarios. La meiosis avanza hasta el estado de diplotene, en el que se detiene poco antes del nacimiento, reiniciándose a la pubertad con cada ciclo ovárico.

Bajo la acción de los andrógenos testiculares, los conductos mesonéfricos de Wolff dan origen en el feto masculino a los epidídimos, conductos deferentes y vesículas seminales. En el sexo femenino, ante la ausencia de hormona anti-Mülleriana (AMH), los conductos paramesonéfricos de Müller forman las tubas uterinas, el útero y el tercio superior de la vagina. Los conductos de Wolff degeneran en el feto XX por falta de andrógenos, en tanto que los conductos de Müller regresan en el feto XY por acción de la AMH (Fig. 3). La próstata se forma a partir del seno urogenital: el mesénquima induce la formación de conductos epiteliales originados en el endodermo del seno urogenital, y éstos últimos inducen la diferenciación de músculo liso a partir del tejido mesenquimático.

Al igual que los genitales internos, los genitales externos dependen de la acción hormonal. Los esbozos indiferenciados evolucionan en sentido masculino bajo la acción de la dihidrotestosterona (DHT), andrógeno potente derivado de la acción de la enzima 5 a-reductasa sobre la testosterona. Así, el tubérculo genital origina el pene, en tanto que los repliegues labioescrotales se agrandan y se fusionan en sentido póstero-anterior para formar las bolsas escrotales (Fig. 2). En el feto femenino, la falta de andrógenos permite que el tubérculo genital origine el clítoris, que los pliegues urogenitales formen los labios menores y que los repliegues labioescrotales permanezcan separados formando los labios mayores (Fig. 2).

DETERMINACIÓN SEXUAL: MECANISMOS MOLECULARES DEL DESARROLLO TESTICULAR

Como es conocido, el sexo del embrión queda determinado en el momento de la unión del óvulo (que aporta un cromosoma X) con el espermatozoide (que puede aportar un cromosoma X o un Y). Desde hace varias décadas se sabe que es la presencia de un cromosoma Y el factor determinante en el desarrollo sexual de la gónada fetal, sin que el número de cromosomas X tenga trascendencia alguna (Grumbach & Conte, 1998). El producto del gen SRY (Sex-determining Region Y-chromosome), presente en el brazo corto del cromosoma Y, induce una proliferación del epitelio celómico de las crestas gonadales en los fetos de sexo masculino (Schmahl et al., 2000) y de la migración de células mesonéfricas hacia la cresta gonadal (Capel, 2000) (Fig. 4). Entre dichas células mesonéfricas, se encuentran los precursores de células de Leydig, de vasos sanguíneos y de otros elementos del tejido intersticial del testículo, así como de las células mioideas peritubulares. La presencia de éstas últimas parece ser determinante para que las futuras células de Sertoli, provenientes al menos en parte del epitelio celómico, se organicen junto con las células germinales provenientes del saco vitelino, formando estructuras cordonales (Fig. 6). La interacción entre las células mesonéfricas y las células del epitelio celómico provocaría la diferenciación de las últimas hacia células de Sertoli (Capel, 2000), las cuales comenzarían a mostrar un patrón de expresión específico, caracterizado por un aumento de SOX9 (otra proteína de la familia de SRY) y de AMH, conjuntamente con una disminución de DAX1 (Swain & Lovell-Badge, 1999).

Si bien no se conocen con precisión los mecanismos moleculares por los cuales actúa SRY, existen evidencias experimentales que SRY y DAX1, cuyo gen se encuentra en el cromosoma X, interactúan en períodos tempranos del desarrollo de las crestas gonadales (Swain et al., 1998). En el individuo XY, existe un solo alelo del gen SRY y un solo alelo del gen DAX1: se entiende entonces que hay una sola "dosis" de proteína SRY y una "dosis" de proteína DAX1. En esas condiciones, SRY parece ser predominante y permitir la diferenciación testicular con la consiguiente expresión de genes típicamente testiculares, como SOX9 y AMH (Fig. 5) (McElreavy et al. 1993; Swain et al., 1998). En ciertas condiciones anormales, la existencia de 2 dosis activas de DAX1 parece ser responsable de niveles elevados de DAX1 que impedirían el desarrollo testicular (Swain et al., 1998; Goodfellow & Camerino, 1999). No sólo los niveles de SRY, sino también su cronología de su expresión es importante: un retraso en la expresión de SRY permitiría una acción anti-testicular de DAX1, resultando en la formación de ovotestes o de gónadas disgenéticas (Nagamine et al., 1999). SRY no es el único gen responsable del desarrollo testicular: otros genes autosómicos también están involucrados en el normal desarrollo de la gónada masculina, aunque sus funciones deben aún ser develadas Katoh-Fukui et al., 1998; Raymond et al., 1999; De Grandi et al. 2000; Grimmond et al. 2000).

En individuos XX, la ausencia de SRY resulta en un aumento de los niveles de DAX1 en la gónada, que se diferencia en sentido ovárico. Sin embargo, DAX1 no parece esencial para el desarrollo del ovario: ratones XX con una invalidación o "knock-out" de DAX1 presentan ovarios (Yu et al., 1998). Lamentablemente, es muy poco lo que se conoce en cuanto a los mecanismos involucrados en el desarrollo ovárico, lo cual ha llevado a decir clásicamente que la sola ausencia de SRY resulta en el desarrollo del ovario. Si bien la ausencia de SRY es imperativa `para que ocurra el desarrollo ovárico, parece lógico imaginar que deba existir además una correcta expresión de genes "pro-ováricos", hasta hoy desconocidos. Uno de los pocos puntos bien definidos es que, contrariamente a lo que ocurre en el testículo, la presencia de células germinales es esencial para el mantenimiento y desarrollo de la gónada femenina; por consiguiente las moléculas involucradas en la proliferación, el mantenimiento y la apoptosis de ovogonias y ovocitos durante la vida fetal están involucradas -indirectamente- en el desarrollo del ovario (Packer et al., 1994; McLaren 1994; Parr & McMahon 1998; Vainio et al., 1999).

DIFERENCIACIÓN SEXUAL: LA IMPORTANCIA DE LAS HORMONAS TESTICULARES

La diferenciación de los esbozos de los órganos genitales internos y externos en sentido masculino o femenino depende de la presencia o ausencia de las hormonas testiculares. La importancia determinante que adquiere entonces el testículo en el resto de la diferenciación sexual fetal ha llevado al nacimiento de la expresión "determinación sexual" para describir a la diferenciación gonadal a partir de las crestas gonadales, usándose la expresión "diferenciación sexual" para describir principalmente a la evolución que siguen los órganos genitales (Goodfellow & Lovell-Badge 1993).

Inmediatamente después de formarse los cordones testiculares, las células de Sertoli fetales secretan hormona anti-Mülleriana (AMH), también conocida como sustancia inhibidora mülleriana (MIS). La AMH es una glicoproteína que se une a un receptor de membrana presente en las células mesenquimáticas que rodean al epitelio de los conductos de Müller (Josso et al., 1997), induciendo apoptosis y transformación epitelio-mesenquimatosa con la consiguiente regresión de los conductos de Müller (Allard et al., 2000). En el sexo femenino, ante la falta de AMH, los conductos de Müller dan origen a las tubas, el útero y el tercio superior de la vagina (Fig. 3). La ventana de acción de la AMH es muy corta: la secreción testicular de AMH comienza a fines de la 7ª. semana, y los conductos de Müller se hacen refractarios a su acción luego de la 10ª. semana, de lo cual se desprende la importancia del patrón temporal de expresión de la AMH.

A partir de la 8ª. semana, las células de Leydig producen andrógenos, responsables de la estabilización de los conductos de Wolff y de su diferenciación en epidídimo, conducto deferente y vesículas seminales, así como de la masculinización del seno urogenital y de los genitales externos (Figura 3). Los andrógenos son hormonas esteroideas sintetizadas a partir del colesterol a través de una larga cadena de reacciones enzimáticas (Forest, 1994). La diferenciación de las células de Leydig, su proliferación y su actividad esteroidogénica dependen del estímulo gonadotrófico proporcionado por la gonadotrofina coriónica humana (hCG) en los primeros seis meses de vida intrauterina y de la hormona luteinizante (LH) hipofisaria en el último trimestre. Tanto la hCG como la LH se unen a un mismo receptor de membrana presente en las células de Leydig, responsable de transducir la señal (Fig. 6).

Los conductos de Wolff expresan el receptor de los andrógenos, receptor nuclear con actividad de factor transcripcional. Al unirse la testosterona a su receptor, se induce la diferenciación del gonaducto en sentido masculino. En el seno urogenital y los esbozos de los genitales externos, la testosterona es transformada en dihidrotestosterona (DHT) por la enzima 5a-reductasa (Fig. 3). La DHT tiene una afinidad 20 veces mayor que la testosterona por el receptor de andrógenos, por lo cual su efecto masculinizante es mucho más potente. En el sexo femenino, la falta de andrógenos resulta en una regresión de los conductos de Wolff y en una feminización de los genitales externos (Figura 5). Sin embargo, un exceso anormal de andrógenos durante la vida fetal puede provocar una virilización de fetos XX, tal como ocurre en la hiperplasia suprarrenal congénita, la causa más frecuente de anomalías del desarrollo sexual fetal (Grumbach & Conte, 1998). La acción estrogénica no juega ningún rol en la morfogénesis temprana de los genitales en el sexo femenino, tal como lo demuestran mutaciones en los receptores de estrógenos (Couse & Korach, 1999). En cambio, los estrógenos son indispensables hormonas tróficas en el desarrollo del útero durante la pubertad.

DIFERENCIACIÓN SEXUAL INDEPENDIENTE DE HORMONAS

Los eventos morfogenéticos de la embriogénesis temprana que dan origen a los esbozos de las gónadas y de los órganos genitales son independientes de factores hormonales y no muestran -a la inversa de lo que hemos visto hasta ahora- ningún dimorfismo sexual. Es fácil comprender que para que las gónadas se diferencien, las crestas gonadales -y por consiguiente, el mesodermo intermedio- debieron desarrollarse normalmente. En los últimos años se han ido descubriendo una serie de factores, que incluye a factores de crecimiento y transformación así como a receptores, involucrados en la morfogénesis temprana de los esbozos gonadales y genitales (Swain & Lovell-Badge 1999; Capel 2000). Puesto que la mayoría de estos factores son ubicuos (por ejemplo: Lhx9 y Emx2, ver Fig. 7), con funciones en diversos tejidos embrionarios, mutaciones en los mismos suelen ser letales.

Sin embargo, otros morfógenos son más específicos de los esbozos urogenitales, por ejemplo WT1 y SF1, que intervienen en la estabilización de las crestas génito-urinarias (Capel, 2000) (Fig. 7), Hoxa-13 (Warot et al., 1997) y Wnt-7a (Vainio et al., 1999), que participan en el desarrollo de los conductos de Wolff o de Müller, y Hox4 (Dolle et al., 1991), con funciones en el desarrollo del tubérculo genital. Estos factores se expresan en ambos sexos durante el período indiferenciado, induciendo la formación de estructuras básicas que podrán eventualmente estar sometidas a la acción de las hormonas gonadales más tarde en el desarrollo.

CONCLUSIONES

La determinación y diferenciación sexual implica una cadena de eventos que involucra a factores cuyos genes se localizan en autosomas o en cromosomas sexuales. Algunos de ellos intervienen en períodos de la embriogénesis temprana, sin que exista una diferencia entre los sexos, mientras que otros -a partir de la expresión de SRY- muestran un claro dimorfismo sexual (Fig. 7). Si la gónada resultante es un testículo, las hormonas por él producidas inducirán una masculinización de los genitales internos y externos. En cambio, si se forma un ovario o ninguna gónada -como puede ocurrir en casos patológicos-, los genitales internos y externos se desarrollarán en sentido femenino. La sola producción de las hormonas masculinas testosterona y AMH no es suficiente para la masculinización: es necesario además que los órganos blanco expresen sus receptores para producir la respuesta biológica adecuada. No debe olvidarse además que el patrón temporal de expresión de genes y secreción de hormonas es determinante en el resultado de la diferenciación sexual. También, un exceso de hormonas masculinas puede provocar la virilización de un feto XX. Finalmente, cualquier alteración en la cadena de eventos de la determinación y diferenciación sexual provocará un cuadro de ambigüedad sexual, cuya explicación deberá razonarse a partir del conocimiento de los posibles mecanismos normales afectados.

Trabajo financiado por PIP nº 0574/98 del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, Argentina) y Beca "Oñativia-Carrillo" del Ministerio de Salud de la República Argentina. R.Rey es Investigador Adjunto de CONICET y docente de Histología, Embriología, Biología Celular y Genética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires, Argentina.

SUMMARY: The sex of the embryo is determined at fertilization by the sex chromosome (X or Y) present in the sperm. However, during several weeks in early human embryogenesis, no evident differences exist -even at the electron microscope level- between a female and a male embryo. From the onset of SRY expression in the XY fetus, the gonads undergo a chain of events determined by specific protein expression which provoke cytological, histological and fucntional changes which are typical features of the testis. Due to its determining importance in the rest of sexual development, testicular differentiation due to SRY has been called sex determination. Once differentiated, the testes secrete two discrete hormones, testosterone and anti-Müllerian hormone, which are responsible for the virilisation of the anlagen of internal and external genitalia. The dimorphic sexual development undergone by internal and external is known as sex differentiation. Very little is known concerning the mechanisms involved in ovarian differentiation in the XX fetus. However, it has been known for long decades that in the absence of testicular hormones, internal and external genitalia feminize, no matter whether ovaries have deloped or not. The increasing bulk of information that is available day after day concerning molecular, cellular and endocrine mechanisms involved in sex determination and differentiation allows a better understanding of the pathology responsible for intersex states.

KEYS WORDS: 1. Ovary; 2. Testis; 3. Genitalia; 4. Sex determination; 5. Sex differentiation; 6. Fetus; 7. Embryo; 9. 9. Microscopy ElectronLight; 10. Morphogenesis

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