SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.19 número2ENSEÑANZA DE LA ANATOMÍA HUMANA: EXPERIENCIAS Y DESAFÍOS EN UNA ESCUELA DE MEDICINAESTUDIO MORFOLÓGICO DE LA GLÁNDULA BULBOURETRAL DE CONEJO (Oryctolagus cuniculus) índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Servicios Personalizados

Revista

Articulo

Indicadores

Links relacionados

Compartir


Revista chilena de anatomía

versión impresa ISSN 0716-9868

Rev. chil. anat. v.19 n.2 Temuco ago. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98682001000200014 

CARACTERIZACIÓN, AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS GERMINALES
PRIMORDIALES DE CONEJO

CHARACTERIZATION, ISOLATION AND CULTURE OF RABBIT PRIMORDIAL GERMINAL CELLS

*Mariana Rojas; **Xavier Vignon; *M. Angélica Montenegro.; ***Mariano del Sol; *Eduardo Bustos-Obregón & **Jaques Fléchon

* Programa de Morfología,  ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
**

Institute National de la Recherche Agronomique, Jouy en Josas, France.

*** Facultad de Medicina Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

RESUMEN: Las células germinales primordiales (CGP) obtenidas directamente del embrión, no son capaces de generar líneas celulares pluripotentes, pero ellas adquieren esta capacidad  si son  mantenidas en cultivos "in vitro". Los objetivos de este estudio fueron: 1) Caracterizar inmunohistoquímicamente las CGP de conejo en sus distintas etapas embrionarias "in vivo". 2)  Reconocer el lugar óptimo para obtener estas células según edad embrionaria. 3) Evaluar si  las células nutricias murinas permiten la proliferación y sobrevivencia de las CGP en cultivo in "vitro" .

Se obtuvieron embriones de 16 conejas de raza Neozelandesa blanca, de 7, 9, 10, 14 y 16 días post coito (dpc). Un grupo de cada camada fue procesado "in toto" y en cortes por congelación con fosfatasa alcalina y dos anticuerpos monoclonales:  TEC-1 (reconoce antígeno SSEA-1 de superficie de las CGP) y  PG-2 (marca el citoplasma perimitocondrial de CGP). Otro grupo de embriones fue cultivado durante 22 días usando células nutricias STO y MI-220.

En embriones de 7 días, el epiblasto del disco embrionario presenta células TEC-1 positivas y  PG-2 negativas.  Esta marca se mantiene así durante la estadía transitoria en el alantoides y durante la migración a través del meso intestinal. Cuando las CGP colonizan la gónada se transforman en  TEC-1 negativas y PG-2 positivas. La capacidad de proliferación "in vitro" de las células germinales primordiales de conejo, resultó ser mucho menor que la observada en ratón. Esto guarda relación con la reducida capacidad de proliferación de estas células "in vivo". La eficiencia proliferativa de las  CGP "in vitro" se correlaciona con la edad del embrión del cual ellos derivan. Por otra parte la morfología de las células "in vitro" guarda también una estrecha relación con la edad del embrión de la cual ellas son aisladas. La edad óptima en la que se obtuvieron mejores proliferación y sobrevivencia en sucesivos pasajes, fue a los 14 días (grupo III). Es decir,  en el período en que ellas están proliferando y migrando  a través  del meso intestinal. Los medios de cultivo de origen murino STO, MI-220 permiten la proliferación y sobrevivencia de las CGP.  

PALABRAS CLAVE: 1. Embriología; 2. Células germinales primordiales; 3. Cultivos celulares; 4. Anticuerpos TEC-1, PG-2.

INTRODUCCIÓN

Las células germinales primordiales  (CGP) son los precursores embrionarios de los gametos y constituyen el único linaje celular capaz de transmitir el genoma a la siguiente generación;  debido a esto, es posible afirmar que las CGP son esenciales para la sobrevivencia de las especies. Esta capacidad de las células germinales para participar en  el proceso de desarrollo embrionario una y otra vez,  indican que las células germinales primordiales son potencialmente inmortales (Donovan et al., 1997; Donovan, 1998; Tsang et al., 2001).  Las células germinales primordiales obtenidas directamente del embrión, no son capaces de generar líneas pluripotentes, en cambio, si ellas son mantenidas "en cultivos in vitro" adquieren esta propiedad. Las células germinales embrionarias (EG) así obtenidas, son muy similares a las células troncales del embrioblasto blastocitario (ES), también pueden formar líneas germinales quiméricas cuando ellas son inyectadas en un blastocisto huésped  (Stetwart et al., 1994) y por otra parte, pueden formar cuerpos embrioides  (Labosky et al., 1994) y también estas células permiten potencialmente la manipulación genómica, pudiendo llegar a ser muy importantes en investigación biotecnológica y en el estudio e inducción de teratocarcinomas (Matsui et al., 1992Donovan, 1998).

Si bien es cierto, Munro (1974) y Yang & Foote (1988) han logrado obtener conejos quiméricos, a partir de células ES (obtenidas del embrioblasto del blastocisto), se ha visto que éste es un sistema poco productivo y muy dificultoso (Kanka et al., 1996);  debido a esto, es el interés de trabajar con células derivadas de células  germinales primordiales embrionarias EG (Moens et al., 1996).   

Los objetivos de este estudio fueron: 1) Reconocer las características inmunohistoquímicas de las CGP, en las distintas fases de su migración y colonización gonadal  "in vivo". 2) Reconocer el lugar óptimo para aislar las células germinales primordiales desde el embrión de conejo, para obtener células pluripotentes. 3) Evaluar si las células nutricias obtenidas de fibroblastos embrionarios de ratón: STO, MI-220, son útiles para favorecer la proliferación y longevidad de las células germinales primordiales de conejo, en cultivo.

Nuestro estudio se desarrolló en conejo por las siguientes razones: 1) En esta especie la diferenciación de las CGP ocurre  durante la gastrulacióm (Ginsburg et al., 1990) y  antes de la implantación, esto facilita la obtención del embrión junto a sus anexos extraembrionarios y su  análisis con los distintos marcadores moleculares fuera del organismo materno.  2) El gran tamaño del disco embrionario ofrece una mayor resolución para definir posición y número de CGP (Viebahn et al., 1998). 3) Los procesos de morfogénesis y diferenciación sexual de la gónada son muy similares con el desarrollo del embrión humano(Byskov & Hoyer, 1988).

Aún cuando tradicionalmente se ha utilizado la fosfatasa alcalina (FA) para marcar células germinales primordiales, no todas las células fosfatasa alcalina positivas de embriones tempranos, contribuyen a la población de CGP (Yeom et al., 1996). Por tal razón, se utilizaron además, dos anticuerpos monoclonales no comerciales, como marcadores de las células germinales primordiales. Uno de ellos es  TEC-1 (Draber & Pokorna, 1984) y el otro es un anticuerpo específico para células germinales primordiales de conejo (Viebahn et al.).

El anticuerpo TEC-1 reconoce el antígeno llamado SSEA-1 (antígeno embrionario específico de estado 1) el cual  se expresa en las superficies de las células germinales primordiales (Solter & Knowles, 1978).  El anticuerpo monoclonal  PG-2 es altamente específico para las células germinales primordiales del embrión de conejo y marca el citoplasma perimitocondrial, debido a que el epitopo del anticuerpo está localizado en el citoplasma asociado con las mitocondrias (Viebahn et al.).

Para los cultivos utilizamos como células nutricias las líneas STO y MI-220, obtenidas de  fibroblastos embrionarios de ratón (Resnick et al., 1992).  La línea STO  produce los factores de crecimiento inhibitorio leucémico (LIF) y factor célula troncal (SCF) (Matsui et al., 1991 y Resnick et al.)  La línea MI-220 expresa solamente el factor celular troncal SCF  (Matsui et al., 1992).

MATERIAL Y MÉTODO

Se utilizaron 16 conejas de la raza Neozelandesa blanca, clínicamente sanas, en edad reproductiva.  Las hembras fueron cruzadas y se determinó como día 0 el momento del coito.  Estos animales procedentes del INRA, Jouy en Josas, Francia, y de la Universidad de La Frontera, Temuco, Chile, fueron sacrificados a los 7,  9, 10, 14 y 16 días post-coito (dpc) y se obtuvieron los embriones, los cuales se depositaron en medio de cultivo DMEM-ES.

Disección de los embriones:

Grupo I: 7 dpc. Se trabajó con los embriones y sus anexos completos "in toto".

Grupo II: 9 y 10  dpc.  Se obtuvo la región caudal del embrión entre el último somito y la base del alantoides. Esta fase es anterior al inicio de la migración de las células germinales primordiales (CGP)  

Grupo III: 14 dpc. Se disecó el mesenterio dorsal, porque es el periodo de migración de CGP a través del meso dorsal.

Grupo IV: 16 dpc. Se realizó disección de las crestas genitales o esbozo pregonádico, debido a que este período coincide con  la colonización de la gónada por parte de las CGP.

Marcaje de CGP con fosfatasa alcalina en embriones «in toto»: Un embrión de cada grupo fue procesado "in toto", para realizar en él una marcación de CGP con fosfatasa alcalina (FA). En los embriones de mayor desarrollo (16 días) se realizó la disección de mesonefros, gónada y gonoductos. Los embriones fueron fijados en  metanol durante 6 minutos, a _20ºC y luego en acetona durante 1minuto a _20ºC. Posteriormente, fueron dejados a temperatura ambiente en  tampón fosfato por 5minutos, se reemplazó el tampón fosfato por la fosfatasa alcalina NBT/ BCIP (Zymed) dejándolo en la obscuridad durante 15 minutos, luego se lavó con tampón fosfato 0.1M y  H20 y el montaje se realizó con Mowiol.

Marcaje con anticuerpos monoclonales específicos para células germinales primordiales de conejo. Dos embriones de cada camada, fueron colocados en moldes plásticos con crioprotector O.C.T Bayer y luego congelados por inmersión en nitrógeno líquido. Posteriormente, se realizaron cortes de 5µm en un crióstato. Estos cortes fueron fijados en metanol (6 minutos, a _20ºC) y acetona (1min a -20ºC), hidratados durante 5 minutos en PBS e  incubados durante una hora con suero de cabra en una dilución 1/10 en cámara húmeda.  A continuación, los cortes fueron incubados con los anticuerpos primarios TEC-1 (1/100) y PG-2 (1/100) durante toda la noche en una cámara humeda. Los anticuerpos secundarios que se utilizaronfueron: para TEC-1, IgM ratón (FITC) 1/200  y  para PG-2 IgG ratón FITC 1/200, durante una hora. Luego, tres  lavados de 5 minutos con PBS y posteriormente, 15 minutos de incubación  con iodure de propidium 1/2000 o Hoechst (1/500) en PBS-BSA 0.2%,  en la oscuridad. Después, los cortes se sumergieron en Tris  pH8, antes de su montaje en Mowiol (Hoechst, Germany). Las señales de fluorescencia fueron observadas en un microscopio de fluorescencia Leica. Los embriones de 7 días fueron procesados de una manera similar pero "in toto".

Preparación de los medios de cultivo: En los cultivos se utilizaron células «nutricias» de las líneas STO, M220, las que fueron  mantenidas en incubadora, a 37ºC, con medio Eagle modificado Dulbecco´s (DMEM, Life Technologies), con 10% de suero fetal bovino (FCS, Biomeda, France), 2 mM de L-glutamina; 10 UI /ml de penicilina-estreptomicina y 1mM de piruvato de sodio. Al preparar las capas de células "nutricias", éstas fueron inactivadas por mitomicina y sembradas en una densidad de 1x105 por cápsula de cultivo, en el mismo medio, 24 horas antes de usar. Las cápsulas fueron pretratadas con 1% de gelatina (piel porcina Sigma).

Cultivos primarios de CGPs:  Las muestras disecadas de embriones fueron disociadas con tripsina/EDTA, a 37ºC, durante 10 minutos. Después de la incubación, las células fueron separadas por pipeteo y diluidas en medio de cultivo DMEM (200µm/embrión), suplementado con suero fetal bovino (FCS), piruvato de sodio, L-glutamina, penicilina-estreptomicina, aminoacidos no esenciales y beta mercaptoetanol. Estas suspensiones celulares fueron sembradas en células «nutricias» inactivadas con mitomicina C. Las líneas celulares: STO,  M220  fueron usadas como células «nutricias». Los cultivos se llevaron a cabo en medio DMEM, con los siguientes factores: factor inhibitorio de leucemia (LIF); factor de crecimiento mastocitario (stem cell factor) y factor de crecimiento fibroblástico (FGF). Los factores de crecimiento fueron adicionados en el día de la siembra, a concentración de: LIF  (5 - 20 ng/ml), FGF (5 - 20 ng/ml), SCF ( 30 - 60 ng/ml) El medio fue cambiado todos los días, agregándose los factores de crecimiento diariamente.

Cultivo secundario de CGPs: A los 6 días, los cultivos primarios fueron tripsinizados y vueltos a sembrar en cápsulas embriológicas que contenían células «nutricias» SI-m220 o STO, en un medio de cultivo para CGP, en dos cápsulas embriológicas. Cada 6 días se hicieron subcultivos.

Detección de CGPs con fosfatasa alcalina: Después de lavar con buffer fosfato salino, las células fueron fijadas con alcohol, a 20ºC, por 5 minutos, lavadas con PBS y teñidas con fosfatasa alcalina (Zymed) durante 15 a 30 minutos, a 37ºC. Al primer y cuarto días  de cultivo, las células  fosfatasa alcalina positivas fueron cuantificadas con un microscopio invertido. En el sexto día se realizó un nuevo pasaje a un medio de células «nutricias» inactivadas.

RESULTADOS

Caracterización inmunohistoquímica de células germinales primordiales.

En el grupo I, correspondiente a embriones preimplantacionales en etapa de gastrulación  (Figs. 1 y 2), al utilizar el anticuerpoTEC-1, fueron observadas muchas células fluorescentes  en el epiblasto y ninguna en el ectoderma extraembrionario (Fig. 3). En cambio, con el anticuerpo específico  PG-2, todas las células fueron negativas.  La FA resultó igualmente negativa en el epiblasto.

El grupo II corresponde a embriones somíticos de 9 a 10 dpc (Figs. 4 y 5) los cuales han establecido relaciones de implantación con la mucosa uterina. Al realizar tinción "in toto" con FA, se observó que todo el tubo neural es positivo, al igual que el alantoides.   Las técnicas TEC-1 y PG-2 resultaron negativas y no fueron evidenciadas células germinales primordiales. En el cultivo de la región próxima al alantoides, durante el primer pasaje, todas las células con tinción FA+ fueron redondas y pequeñas, se presentaban aisladas y formaban numerosas colonias de, aproximadamente, 8 a 10 células. En la  Fig.  6 se observa el día 4 del cultivo primario en células «nutricias» STO. En los sucesivos pasajes estas células proliferaron muy poco, alcanzando a los 16 días un máximo de 40±12 células, (Fig. 7), posteriormente,  disminuyeron hasta desaparecer. 

Fig. 1.  Blastocisto de conejo de 7 dpc con  disco embrionario al centro. En el disco embrionario se identifica la linea primitiva. Periféricamente al disco embrionario están las membranas extraembrionarias. 40X   Fig. 2. Blastocisto de conejo, disco embrionario muy nítido, las membranas extraembrionarias se han cortado parcialmente. 40X.
Fig. 3. Polo posterior del disco embrionario, anticuerpo TEC-1. Las células del epiblasto son positivas y las células vecinas del ectoderma extraembrionario negativas. 200X. Fig. 4. Visión lateral de embrión somítico de 10 dpc. Esbozo del alantoides (flechas).

Fig. 5. Visión ventral de embrión somítico de 10 dpc. Esbozo del alantoides (flechas).

Fig.  6. Cultivo primario de células próximas al alantoides  sobre células STO (día 4). Células FA+. 400X.
Fig. 7. Colonia de células FA+ provenientes de embriones del grupo II que proliferan  sobre las células STO inactivadas. 400X.

Fig. 8. Meso intestinal procesado  con técnica  TEC-1.  Se observan células estrelladas  con prolongaciones. 400X.

Fig. 9.  Células germinales primordiales con fenotipo de célula migratoria, débilmente FA+. 400X

Fig. 10. Se observan células con prolongaciones. 200X.

El grupo III esta constituido por embriones de 14 días. Son embriones con esbozos de extremidades anteriores y posteriores, internamente el mesonefro está bastante desarrollado y el esbozo gonádico está en formación.  Al disecar el meso intestinal  y procesarlo con técnicas TEC-1, se observan células positivas con aspecto mesenquimático y  prolongaciones (Fig. 8); sin embargo, al procesar los mismos cortes con PG-2, la tinción fue negativa. En los cultivos del grupo III se observaron células germinales primordiales con un fenotipo de célula migratoria de forma estrellada y largas prolongaciones o lamelipodios (Figs. 9 y 10) las que parecen migrar en grandes grupos  hacia una  misma dirección en el pocillo.  En cada pocillo es posible cuantificar entre doscientos y trescientos células FA+, débilmente teñidas. Junto con estas células estrelladas, se encontraron células redondeadas sin prolongaciones y fuertemente FA+, las cuales probablemente correspondían a colonias en proliferación.

En los embriones del grupo IV,  se diferenció un esbozo gonádico  en la región ventromedial del mesonefro. Con la técnica de PG-2 se distinguen claramente las CGP (gonocitos) entre las células del mesénquima. (Figs.  11 a y b) la forma redondeada y el gran tamaño de estas células permite reconocerlas fácilmente. Con TEC-1 resultaron todas las células negativas,  con  FA, resultaron positivos el epitelio celómico, algunos túbulos mesonéfricos, los conductos de Wolff (mesonéfricos) de Müller (para-mesonéfricos) y, además,  las células sanguíneas. En  los cultivos de células provenientes de este grupo hubo una proliferación muy  baja de CGP, solamente en el tercer pasaje se logró obtener un promedio máximo de 30 células FA+.

Fig. 11a. Esbozo gonádico de embriones del grupo IV con 16 dpc. Se observan dos gonocitos PG-2 positivos de color  rojo. Está técnica destaca solamente el citoplasma perimitocondrial.  Los núcleos fueron teñidos azul con tinción de Hoechts de color azul. 400 X.

Fig. 11b. Es la misma imagen anterior, pero sólo con tinción nuclear Hoechts,  los gonocitos son grandes y redondeados, fácilmente reconocibles. 400X. 

Cultivos de celulas germinales primordiales

En relación a los cultivos de células germinales primordiales provenientes de los cuatro grupos, se observó que el número de  células  FA+, durante el primer día de cultivo en los diferentes grupos etarios, fue muy bajo (entre 0 y 16 células). A los 4 días de cultivo se evidencia un incremento de las CGPs con diferencias que varía  según las células «nutricias utilizadas». Con un rango de 20 a 58 en el medio M-220 y de 2 a 49 en STO.

En cuanto a las edades de gestación utilizadas,  se observó una diferencia significativa  de células germinales  FA+  en los cultivos provenientes del grupo III  (470 ± 20 células) en comparación con el grupo II (30 ±10 células) y el grupo IV  (30 ±12 células).

Durante los sucesivos pasajes, las células FA+ aumentaron notoriamente. En el grupo III,  durante el segundo pasaje aumentaron  a 198 y luego durante el tercer pasaje aumentaron hasta 489 (STO) y 464 (MI-220).  En los grupos II y IV este incremento fue menor, es decir, durante el segundo pasaje aumentaron sólo a 34 (M220)  y en el tercer pasaje a 40.

Tabla I. Número de células fosfatasa alcalina positivas cuantificadas en los días 1,4,12,16 y 22 de cultivo, en cada uno de los grupos etarios.

DISCUSIÓN

En el grupo I (embriones de 7dpc) no se identificaron células con actividad FA+ en el epiblasto del disco embrionario ni tampoco en las membranas extraembrionarias. Con el anticuerpo TEC-1 (reconoce el antígeno SSEA que  se expresa en la superficie de las CGP)   resultaron positivas muchas células, tanto en el polo  proximal  como en el polo distal del disco embrionario.  Esto se puede relacionar con los trabajos que indican que las células del epiblasto proximal y distal son igualmente competentes para formar CGP, pero que la diferenciación de las CGP ocurre gracias a influencias locales ambientales, que son únicas en el epiblasto proximal (MCLaren, 2000 y Tsang et al., 2001), y que en este caso aún no han ocurrido. Con el anticuerpo PG-2 específico para CGP de conejo (Viebahn et al.)  no se observaron células positivas lo cual indica que éstas aún no se han diferenciado.  Debido a ello, es  que no fueron realizados cultivos celulares en este grupo.

En el grupo II con la FA,  resultaron positivas todas las células del tubo neural y algunas células germinales primordiales que se encontraban en la región proximal del disco embrionario, muy cercano al alantoides. El número de células germinales primordiales fue muy escaso. No obstante esto, para realizar cultivos de estas células sin contaminación de células neurales, se utilizó solamente la región comprendida entre el último somito y el esbozo del alantoides.  En los sucesivos pasajes, en el cultivo, estas células proliferaron muy poco. Puede estar relacionado con lo que sucede "in vivo", en que también se observan muy pocas células y no hay mitosis  en este período. Chretien (1966,1968)  logró cuantificar sólo 9 CGP  en el embrión de conejo.

En el grupo III  se identificaron  las células germinales migratorias en el meso intestinal.  Con la técnica TEC-1 se observaron células fluorecentes  positivas con aspecto mesen-quimático y  prolongaciones.  Con PG-2 la tinción fue negativa. Cuando se realizaron cultivos utilizando el meso intestinal también se observaron CGP con un fenotipo de células migratorias de forma estrellada y con una importante cantidad de colonias en  proliferación. Esto es similar a las  observaciones de Stott  & Wylie (1986), quienes indican que en el ratón, las CGP tienen el fenotipo de células migratorias, cuando son aisladas y cultivadas sobre las células «nutricias» STO.

En el grupo IV, con el anticuerpo  PG-2 se marcaron las CGP (gonocitos), en cambio, con TEC-1 resultaron todas las células negativas. Esto concuerda con los estudios de Draber & Pokorna quienes indican que TEC-1 se expresa en las superficies celulares de las CGP durante el período de migración y se pierde después que estas células colonizan el esbozo gonádico. Por otra parte, en  los cultivos de las células provenientes de este grupo, hubo una proliferación muy  baja de CGP.

La capacidad de proliferación"in vitro" de las células germinales primordiales de conejo resultó ser mucho menor que la observada en ratón; lo que podría deberse, en parte, a los medios de cultivos de origen murino. Sin embargo, se debe destacar que estas líneas celulares murinas tales como STO, MI-220,  permiten la proliferación y migración de las CGP.  Otro factor es la especie;  cuando se compara "in vivo" el número de CGP en ambos animales, se observa  que en el ratón a los 8.5 dpc se encuentran entre 50 a 100 CGP, hasta llegar a un máximo de 25.000 a los doce días y medio (Resnick et al. y Gomperts et al. 1994). En el conejo, en cambio, a los 9 días hay menos de 10 CGP, posteriormente a los 14 días éstas aumentan a 180 células, para llegar a un máximo entre 220 y 1620 a los 16 días (Chretien, 1966,1968). 

La eficiencia proliferativa de las  CGP "in vitro" se correlaciona con la edad del embrión del cual ellos derivan. Por otra parte, la morfología de las células "in vitro" guarda también una estrecha relación con la edad del embrión del que son aisladas. La edad crítica en que se obtuvieron una mejor proliferación y sobrevivencia en sucesivos pasajes fue a los 14 días (grupo III). Es decir,  en el período en que ellas están proliferando y migrando  a través  del meso intestinal.

AGRADECIMIENTOS: Queremos agradecer al Dr. Viehban la donación de los anticuerpos PG-2 y al Dr. Draber por el aporte de TEC-1.

SUMMARY: Primordial germ cells (PGC) directly obtained from the embryo are not able to start pluripotent cell lines but they do so if cultured in vitro. The aims of this work are. 1) characterize by immunohistochemistry the rabbit PGC in their different "in vivo" embryonary stages; 2) identify the optimal site to obtain these cells according to embryonic age and 3) to evaluate if murine feeder cells permit proliferation and survival of PGC cultured "in vitro".

Embryos were obtained from 16 White New Zealand rabbits of 7, 9, 10-14 and 16 days post coitum (dpc). A group of each litter was processed "in toto"and in frozen sections for stainning for alkaline phosphatase and two monoclonal antibodies, TEC-1 (identifies the PGC surface antigen SSEA-1), PG-2 that stains PGC perimitochondrial cytoplasm. Another group of embryos of each litter were cultured "in vitro" for 22 days using STO and MI-220 as feeder cells.

In 7 days embryos, the epiblast of the embryonic disk present TEC-1 possitive and PG-2 negative cells. This mark is retained during the transitory stage in the alantoid and migration along the intestinal mesentery. When PGC colonize the gonad they become TEC-1 negative and PG-2 positive.  "In vitro"  proliferative ability of rabbit PGC is less than that observed in mice. The former cells have a reduced proliferation also "in vivo". The "in vitro" proliferative efficiency of PGC correlates well with the age of the embryo from which they derive and so does also their morphology.  In conclusion, the optimal age for best proliferation and survival "in vitro" was at 14 days, that is the period when PGC are proliferating and migrating along the intestinal mesentery "in vivo". The murine culture medium with STO and MI-220 allow proliferation and survival of rabbit PGC.

PALABRAS CLAVE: 1. Embryology; 2. Primordial germ cells; 3. Cell culture; 4. Antibodies TEC-1, PG-2.

Financiado parcialmente por proyecto ECOS-CONICYT.

Dirección para correspondencia:

Prof. Dra. Mariana Rojas R.
Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Santiago - CHILE
Email: mrojas@machi.med.uchile.cl

Recibido : 22-01-2001
Aceptado: 16-03-2001

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Byskov,  A.G. & Hoyer, P. E.  Embryology of mammalian gonads and ducts. In: Knobil E, Neill J. (8eds) The phisiology of reproduction, Raven Press, New York, 1988. pp  265-302.         [ Links ]

Chretien, F. C. Etude de l'origine, de la migration et de la multiplication des cellules germinales chez l'embryon de lapin. J. Embryol. Exp.Morph., 16:591-607, 1966.         [ Links ]

Chrétien, F. C. Mise en évidence des gonocytes primordiaux de l'embryon de lapin par leur teneur en phosphatase alcaline. Annales D´Embryologie et de Morphogenèse, 1:367-372, 1968.         [ Links ]

Draber, P. &  Pokorna, Z. Differentiation antigens of mouse teratocarcinoma stem cells defined by monoclonal antibodies. Cell Differ., 15:109-13. 1984.         [ Links ]

Donovan, P. J.; Resnick, J. M.; Cheng, L. & Lock, L. Towards the use of primordial germ cells for germline modification. In: Transgenic animals generation and use, Ed Houdebine L.M. Harwood academic publishers, 1997.         [ Links ]

Donovan, P. J. The germ cell. The mother of all stem cells. Int. J. Dev. Biol., 42:1043-50, 1998.         [ Links ]

Ginsburg, M.; Snow, M. H. L. & Mc Laren, A.  Primordial germ cells  in the mouse embryo during gastrulation. Development, 110: 521-8, 1990.         [ Links ]

Gomperts, M.; García Castro, M.; Wylie, C. & Heasman, J.  Interaction between primordial germ cells plays a role in their migration in mouse embryos. Development, 120:135-41, 1994.         [ Links ]

Kanka, J.; Hozak, P.; Heyman, Y.; Chesne, P.; Degrouard, J.; Renard, J. P. & Fléchon, J. E. Transcriptional activity and nucleolar ultrastructure of embryonic rabbit nuclei after transplantation to enucleated oocytes. Mol. Reprod. Dev., 44:63-70, 1996.         [ Links ]

Labosky, P. A.; Barlow, D. P. & Hogan, B. L. Embryonic germ cell lines and their derivation from mouse primordial germ cells. Ciba foundation Symposium. 182:157-78. Eds J. Marsh & J.K Goode, J. Wiley & Sons Ltd U. K., 1994.         [ Links ]

Mc Laren, A. Establishment  of the germ cell lineage in mammals. J. Cell. Phisiol., 182:412-3, 2000.         [ Links ]

Matsui, Y.; Toksoz, D.; Nishikawa, S.; Nishikawa, S.; Williams, D.; Zsebo, K. & Hogan, B. L. Effect of Steel factor and leukaemia inhibitory factor on murine primordial germ cells in culture. Nature, 353:750-2, 1991.         [ Links ]

Matsui, Y.; Zsebo, K. & Hogan, B. L. M. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell, 70:841-7,1992.         [ Links ]

Moens, A.; Betteridge, K. J.; Brunet, A. & Renard, J. P. Low levels of chimerism in rabbit fetuses produced from preimplantation embryos microinjected with fetal gonadal cells. Mol. Reprod. Dev. 43:38-46, 1996.         [ Links ]

Munro, A. J. Succesful construction of chimaeric rabbit. Nature, 250:146-7, 1974.         [ Links ]

Resnick, J. L.; Bixler, L. S.; Cheng, L. & Donovan, P. J. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture. Nature, 359:550-1, 1992.         [ Links ]

Solter, D. & Knowles, B. Monoclonal antibody defining a stage-specific mouse embryonic antigen (SSEA-1) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5565-69, 1978.         [ Links ]

Stewart, C. L.; Gadi, I. & Blatt, H. Stem cells from primordial germ cells can re-enter the germline. Developmental biology 161:626-8, 1994.         [ Links ]

Stott, D. & Wylie, C. Invasive behaviour of mouse primordial germ cells in vitro. J. Cell Sci., 86:133-44, 1986.         [ Links ]

Tsang, T. E;  Khoo, P.; Jamieson, R.V.;  Zhou, S. X.; Ang, S.; Behringer, R. & Tam, P. P. L.  The allocation and differentiation of mouse primordial germ cells. Int. J. Dev. Biol., 45:549-55, 2001.         [ Links ]

Viebahn, C.; Miething, A. & Watenberg, H.  Primordial germ cells of the rabbit are specifically recognized by a monoclonal antibody labelling the perimitochondrial cytoplasm. Histochem. Cell Biol., 109:49-58, 1998.         [ Links ]

Yang, X. & Foote, R. H Production of chimeric rabbits from morulae by a simple procedure. Gamete Research, 21:345-51, 1988.         [ Links ]

Yeom, Y. I.; Fuhrmann, G.; Ovitt, C. E; Brehm, A.; Ohbo, K.; Gross, M.; Hubner, K. & Schóler,  H.R. Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells. Development, 122:881-94, 1996.         [ Links ]

Creative Commons License Todo el contenido de esta revista, excepto dónde está identificado, está bajo una Licencia Creative Commons