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Revista chilena de anatomía

versión impresa ISSN 0716-9868

Rev. chil. anat. v.19 n.3 Temuco dic. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-98682001000300008 

PRESENCIA DE CBG EN EL ESTROMA OVÁRICO DE MAMÍFEROS

CBG PRESENCE IN THE OVARIC STROMA OF THE MAMMALS

Bélgica Vásquez

Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Chile.
Tesis de Licenciatura en Tecnología Médica, Universidad de La Frontera, Chile.

RESUMEN: La globulina unidora de corticoides (CBG) presente en el plasma, tiene la capacidad de unir de forma reversible hormonas esteroidales (cortisol, corticosterona y progesterona). Esta molécula, juega un rol directo en el transporte de esteroides, alterando su concentración en la sangre, e influenciando en su acción hormonal. Se sintetiza principalmente en el hígado, pero también se ha observado en otros órganos, tales como: riñón, hipófisis, próstata, endometrio y placenta. El objetivo del estudio, fue rastrear a través de inmunocitoquímica (ICQ), la probable presencia de CBG en el estroma ovárico de vacas, perras, gatas y ratas, como aproximación morfológica a la dilucidación del rol que podría cumplir esta molécula en el sistema reproductor de mamíferos.

Las muestras de ovarios fueron fijadas en methacarn e incluidas en paraplast. A cortes seriados se les realizó la ICQ por el método del PAP. El anticuerpo específico fue policlonal anti CBG humana.

Los resultados revelaron selectivamente células intensamente inmunopositivas a CBG en Cummulus oophorus y células de la granulosa y, además, en ciertos tipos celulares distribuidos en el estroma ovárico de todas las especies mamíferas estudiadas. Estas células se encontraron en íntima asociación a vasos sanguíneos de alto intercambio, presentando variaciones en la densidad celular, que dependieron de los cambios ováricos cíclicos. Este hecho revela, que la CBG, podría jugar un rol directo en los procesos reproductivos relacionados con el transporte de hormonas esteroidales en el sistema reproductor de estos mamíferos.

PALABRAS CLAVE: 1. CBG; 2. Ovario; 3. Inmunocitoquímica; 4. Bos taurus; 5. Canis familiaris; 6. Felix catus; 7. Ratus norvergicus.

INTRODUCCIÓN

La globulina unidora de corticoides (CBG), está presente en el plasma humano. Ella pertenece a la superfamilia de las serpinas, las cuales provienen de un precursor común cuya presencia se estima en alrededor de 500 millones de años (Huber & Carrell, 1989; Schulze et al., 1994). En el curso de la evolución, una parte de esta superfamilia perdió su propiedad de inhibir proteinasas, como también, la de transportar proteínas. Sin embargo, han mantenido la capacidad de unir, con alta afinidad, hormonas esteroidales tales como, cortisol, corticosterona y progesterona (Rosner, 1991).

Rosner et al., (1988) relataron que la CBG podría desempañear un rol directo en la acción intracelular de las hormonas esteroidales en sus tejidos efectores y que actuaría como reservorio intracelular o buffer, en la regulación de la función de estas hormonas libres. Además, otros investigadores observaron que la CBG presentaba sitios de unión saturables, específicos y de alta afinidad (Hryb et al., 1986; Singer et al., 1988), participando directamente en esta unión, un residuo de cisteína (Khan & Rosner, 1977).

La CBG plasmática, es sintetizada y secretada por el hígado (Perrot-Applanat & Milgrom, 1979 y Rosner), detectándose su presencia, a través de la inmunocitoquímica (ICQ), en otros órganos y tejidos, tales como riñón (Feldman et al., 1973), hipófisis (De Kloet & McEwen, 1976), glándula tiroidea (Kuhn et al., 1986), pulmones (Giannopoulos, 1976) y músculo esquelético (Mayer et al., 1975). Peña et al., (1996) y Baltes et al., (1998) aportaron evidencias morfológicas que demostraban su presencia, con probables sitios de síntesis y secreción, en el sistema reproductor femenino. Posteriormente, Peña et al., (1999) observaron que la CBG estaba presente en el sistema reproductor de vacas y Vásquez et al. (2000) en cerdas, perras, gatas, conejas y ratas.

En tejido endometrial humano normal, Misao et al., en 1994, detectaron CBG mRNA a través de análisis de Northern blot y PCR. Estos autores, correlacionaron las hormonas esteroidales: estrógeno y progesterona, con la regulación de la síntesis de CBG, siendo reportado posteriormente, en cuerpo lúteo humano (Misao et al., 1997 y 1999a), estableciendo, para ambos casos, mayores niveles de producción en la fase secretora del ciclo endometrial. Además, se demostró su presencia en células trofoblásticas sinciciales de placenta humana y su relación con el transporte de hormonas esteroidales (Misao et al., 1999b). Estas evidencias hacen sugerir que la CBG juega un importante rol en el transporte de esteroides y que su presencia y lugar de síntesis podría estar relacionada con las células blanco de las hormonas que ella transporta.

El objetivo de este estudio fue determinar mediante ICQ, la presencia de CBG inmunorreactiva en el estroma ovárico de vacas, perras, gatas y ratas, como aproximación morfológica al rol que cumple la CBG, en relación al transporte de hormonas esteroidales en el sistema reproductor.

MATERIAL Y MÉTODO

Obtención y procesamiento de las muestras de tejidos: Las muestras de ovarios de vacas (Bos taurus) en diferentes estadios del ciclo reproductivo y también de vacas preñadas (segundo tercio), fueron recolectadas desde el Matadero de Animales de Temuco, Chile y transportadas al laboratorio, en solución salina enfriada en hielo. Los ovarios de perras (Canis familiaris), gatas (Felis catus) y ratas (Ratus norvergicus), fueron obtenidas por ovariectomías realizadas en el Hospital de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Católica de Temuco, Chile. Ellas provenían de ovarios que se encontraban en diferentes estadios del ciclo reproductivo y en estado de gestación. Las muestras inmediatamente fijadas en methacarn se procesaron para la inclusión en paraplast. De cada muestra realicé cortes seriados de 5-7 µm, los cuales monté en portaobjetos con poly-l-lysina (Sigma P-1524). Para la observación microscópica y la toma de fotografías utilicé un microscopio Carl Zeiss, Axiolab, c/cámara MC 80 DX.

Inmunocitoquímica: Para la ICQ usé el método de PAP, según técnica del segundo anticuerpo (Ac) (Sternberger et al., 1970). Para la saturación de sitios de unión inespecíficos incubé con BSA al 5%. En el rastreo inmunocitoquímico utilicé como anticuerpo específico un policlonal (-) hCBG, obtenido en conejo (Biogenesis Inc, USA; y de propia producción), la dilución usada para este Ac varía según la especie; en vacas, perras y gatas (dilución 1/30), en ratas (dilución 1/50). El segundo Ac fue: Dako Z0196 y el tercer Ac, PAP conejo: Dako, Z0113.

El revelado de la inmunotinción lo realicé con 3,3'- diaminobenzidina (Sigma, D-5637), en presencia de H2O2 (Merck 1.07210). Los controles negativos fueron realizados en cortes seriados, vecinos a los inmunopositivos, por incu-bación con sueros de conejos no inmunes. Para los controles positivos utilicé hígado de rata, usando para su rastreo ambos anticuerpos policlonales anti hCBG. Una vez finalizada la reacción, teñí los preparados con hematoxilina por 10-30 segundos, como contraste nuclear. Para el montaje usé Permount (Fisher, USA).

RESULTADOS

Los resultados obtenidos con ICQ, fueron los siguientes:

En todas la especies observé una intensa y selectiva reacción inmunopositiva (marcaje color café, tipo granular, distribuido en el citoplasma) en células foliculares, material floculado del fluido folicular y en células de la teca interna de los folículos ováricos, lo cual contrasta nítidamente con los controles negativos.

A nivel del estroma ovárico, encontré células con citoplasma granuloso e intensamente positivos para la CBG inmunorreactivas, ya sea, en ovarios de animales en edades reproductivas y con su ciclo ovárico activo, como también, en aquellos ovarios provenientes de animales en estado de gestación. Estas células estaban en forma aislada (Fig. 1) o en pequeños grupos (Fig. 2), pero siempre diseminadas por el estroma ovárico y sin presentar asociación a elementos foliculares activos o residuales. Sin embargo, la mayoría fue observada en íntima asociación con vasos sanguíneos de alto intercambio (vénulas y capilares) (Fig. 3). Por otro lado, en vacas preñadas (sobre 3 meses), el número de células inmunopositivas y la intensidad de la tinción observada fueron mucho mayores que en animales no preñados (Fig. 4). Estos resultados contrastan con los controles negativos realizados en cortes adyacentes a los inmunorreactivos y en el que sólo se destacó la tinción nuclear.


Fig. 1. ICQ anti CBG en células del estroma ovárico de gatas. a) Células inmunopositivas distribuidas aisladamente en el estroma, sin relación a estructuras foliculares. b) Control negativo en cortes seriados vecinos. 630x.


Fig. 2. ICQ anti CBG en células del estroma ovárico de ratas. a) Células inmunopositivas distribuidas en grupos en la zona cortical del ovario. b) Control negativo en cortes seriados vecinos. 630x.


Fig. 3. ICQ anti CBG en células del estroma ovárico de perras. a) Células inmunopositivas en asociación a vasos sanguíneos de alto intercambio. b) Control negativo en cortes seriados vecinos. 630x.


Fig. 4. ICQ anti CBG en células de estromal ovárico de vacas. a) Células estromales de ovarios de vacas preñadas, con inmunotinción positiva, distribuida en gran parte del estroma ovárico. b) Control negativo en cortes seriados vecinos. 400x.

DISCUSIÓN

El rol fisiológico de la CBG es unir de forma reversible, hormonas esteroidales, para luego transportarlas a través del plasma a sus distintos órganos blanco. Estas hormonas, son rápidamente liberadas, difunden pasivamente en el plasma y cruzan las membranas para, posteriormente, iniciar su acción hormonal (Pardridge,1987; Mendel, 1989). Sin embargo, Rosner et al. indicaron que la CBG podría, jugar un rol directo en la interacción esteroidal intracelular. Autores como Nakhla et al., (1988) han reportado que el complejo CBG-hormona esteroidal induce actividad de la adenilato ciclasa, con una subsecuente acumulación de AMPc. Junto con estos antecedentes, se han descrito sitios de unión para CBG en las membranas plasmáticas de hígados humano y de rata (Strel`chyonok & Avvakumov, 1983; Maitra et al., 1993), próstata (Hryb et al.), bazo (Singer et al.), endometrio (Avvakumov et al., 1988) y sincicio-trofoblasto placentario (Avvakumov & Strel`chyonok, 1988) y en este trabajo, se detectó la presencia de células inmunoposi-tivas a CBG en el estroma ovárico de las especies estudiadas.

Los resultados mostraron, que la síntesis de CBG se correlaciona con los niveles séricos de las hormonas esteroidales. De esta manera, las células inmunorreactivas presentaron claras variaciones en la densidad celular, asociadas a cambios ováricos cíclicos o del estado reproductivo. Este hecho, coincide con estudios realizados por Misao et al., (1994, 1997 y 1999a), quienes señalaron que la mayor producción de CBG en endometrios normales y cuerpo lúteo humano se produce en la fase secretora del ciclo ovárico.

Misao et al., (1999b), observaron a través de hibridi-zación in situ, un aumento en la síntesis de CBG en células trofoblásticas de la placenta humana, concordando con lo observado en ovarios provenientes de hembras preñadas, donde la densidad celular fue significativamente mayor. Este hecho, evidencia la necesidad de contar con esta molécula para el transporte hormonal, principalmente de progesterona, imprescindible en los procesos de desarrollo, formación y mantención de la placenta. Estos resultados, concuerdan con lo observado por Rosner et al., quienes describieron que entre el 6º y el 7º mes embarazo los niveles séricos de CBG aumentan de 2 a 2.5 veces, en comparación con mujeres no embarazadas. Quizás este aumento sustancial en la síntesis de CBG, se deba a que la producción por parte de la placenta, y de otros tejidos del sistema reproductor, de alguna manera, contribuyen a la producción hepática.

Otro hecho que llama la atención, es que estas células se presentaron en íntima asociación a vasos sanguíneos de alto intercambio, lo que sugiere, al menos morfológicamente, que la CBG podría estar involucrada, desde un punto de vista integrativo, en la función ovárica misma. En este sentido, su secreción estaría orientada a alcanzar el lecho vascular y desde allí lograr otros objetivos situados en la vecindad o a distancia.

Que las especies mamíferas estudiadas presenten resultados similares, sólo con intensidades distintas, por un lado apuntaría a probables variaciones inter especies en la molécula misma, que el anticuerpo no es capaz de detectar, pero por otro lado, permite sugerir que la CBG estaría involucrada en mecanismos esenciales que pueden ser compartidos por otros mamíferos. El rastreo de esta molécula en otras especies, distintas a la humana, sólo ha sido posible realizarla utilizando un anticuerpo policlonal contra CBG humana pura, debido a que hasta la fecha no se ha aislado la CBG del sistema reproductor de otras especies.

SUMMARY: The plasma corticoid binding globulin (CBG), has the capability to irreversible fixes steroid hormones (cortisone, corticosterone and progesterone). This molecule, acts directly on  the steroid transports,  changing their blood concentration and  influencing the hormonal action. The synthesis occurs mainly in the liver, but also in other organs and tissues such as the kidney, pituitary, prostate, endometrium and placenta.

The objective of this study was to trace the presence of CBG on the ovarian stroma of the cow, bitch, cat and rat under a morphological point of view using an inmunocytochemical (ICQ) method.

The ovarian samples were fixed in methacarn and embedding in paraplast. Serial cuts were performed to each sample and  the ICQ was done using the PAP method and an specific  polyclonal CBG human antibody was used.

The results showed a selective immune positive reaction to CBG on the cummulus oophorus and granulosa cells.  In addition, some other types of cells found in the ovarian stroma in all the species studied showed a similar reaction. The immune reaction and the cell density varied according the state of the ovarian cycle. These cells were found in close contact with the blood vessels where a high interchange occurs.

In conclusion, these results show that the CBG could be directly involved  in the reproductive process related to the  steroidal hormonal transports in the female reproductive system of these mammalian species.

KEY WORDS: 1. CBG; 2. Ovary; 3. Immunocitochemistry; 4. Bos taurus; 5. Canis familiaris; 6. Felix Catus; 7. Ratus norvergicus.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mi Tutor Prof. Patricio Peña S.; al Prof. Carlos Veuthey T., Médico Veterinario y Profesor de la Universidad Católica de Temuco, Chile, quien efectuó las ovarectomías; al Dr. Marcelo del Campo por la obtención de las muestras de ovario de bovinos; y por su apoyo logístico al Centro de Biotecnología en Reproducción de la Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

Dirección para correspondencia:
T. M. Bélgica Vásquez P.
Facultad de Medicina
Universidadd de La Frontera
Casilla 54-D
Temuco - CHILE

Email:bvasquez@ufro.cl

Recibido : 11-04-2001
Aceptado: 22-08-2001

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