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Gayana (Concepción)

versión impresa ISSN 0717-652Xversión On-line ISSN 0717-6538

Gayana (Concepc.) v.64 n.2 Concepción  2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-65382000000200006 

ACTIVIDAD CONTRACTIL DEL MUSCULO PAPILAR CARDIACO Y
 CONDUCTO DEFERENTE DE RATA INDUCIDA POR VENENO DE LA
ARAÑA LATRODECTUS MACTANS DE CHILE

CONTRACTION ACTIVITY OF THE APPILLAR MUSCLE AND VAS
DEFERENT OF A RAT INDUCED TO POSITION FROM THE  LATRODECTUS
MACTANS SPIDER OF CHILE

Fernando Romero1, Elena Altieri1, Carlos Quiñehual2 y Alejandra Cayuqueo3

1Departamento de Ciencia Preclínicas - CEBIOR, Facultad de Medicina, Universidad de la Frontera,
Casilla 54-D,Temucho, Chile. E-mail: fromero@ufro.cl

2Tesista de carreta Tecnología Médica.
3Tesista de carreta Tecnología Médica y ayudante de investigación Proyecto DIUFRO Nº 9731.

RESUMEN

La araña Latrodectus mactans al morder inocula su veneno, el cual induce un cuadro clínico denominado latrodectismo sistémico, del que se desconocen sus efectos en tejidos aislados. Nuestro laboratorio ha obtenido veneno de esta especie de arácnido mediante la técnica de extracción de glándula, lo que permitió iniciar estudios de la reactividad muscular inducida por extracto de glándula y una fracción purificada bioactiva sobre músculo liso, utilizando como modelo preparaciones de músculo aislado papilar cardiaco y conducto deferente de rata. Los resultados muestran que estas toxinas generan un efecto miotónico en el tejido muscular liso del conducto deferente y en el tejido cardiaco inducen inotropismo positivo y aumento de la frecuencia de contracción. Nuestros resultados permiten demostrar que el veneno de esta araña estimula la reactividad contráctil en tejido muscular cardiaco y liso, y sugieren que el efecto principal se debe a la acción de una fracción proteica estructuralmente similar a la alfa-latrotoxina de arañas europeas y asiáticas.

Palabras claves: Araña viuda negra, Latrodectus mactans de Chile, músculo cardiaco, conducto deferente, contracción.

ABSTRACT

The spider Latrodectus mactans inoculates its poison when biting, this induces a clinical chart named systemic latrodectism, its effects are ignored in isolated tissues. Our laboratory has obtained poison of this arachnid species by means of the gland extraction technique. This allowed us to begin studies of the muscular reactivity induced by gland extract and a purified bioactive fraction on smooth muscle, using as a pattern isolated cardiac papillar muscle and rat vas deferent. The results show that these toxins generate a miotonic effect in the smooth muscle of vas deferent, and positive inotropism and an increase in the frequency of contraction in the heart tissue. Our results demonstrate that the poison of this spider stimulates the contractile reactivity on cardiac and smooth muscular tissue, and also suggest that the main effect is due to the action of a proteinous fraction, structuraly similar to the alfa-latrotoxin from european and asian spiders.

Keywords: Black widow spider, Latrodectus mactans of Chile, heart muscle, vas deferent, contraction.

INTRODUCCION

La araña Latrodectus mactans de Chile perteneciente al orden Araneae, sub-orden Labidognatha, familia Theridiidae, género Latrodectus, especie mactans, de Chile (Zapfe 1959), conocida como "araña del trigo" o "viuda negra", correspondiente a la fauna ponzoñosa biocenótica de especies de fanerotóxicas. Su mordedura a humanos genera un efecto sistémico conocido como "latrodectismo" o "aracnoidismo sistémico". Se sabe que el veneno está constituido por varias neurotoxinas que inducen una sintomatología clínica que se caracteriza por dolor generalizado, dolor abdominal agudo, calofríos y/o temblor, fiebre, vómitos, taquicardia, hipertensión arterial, secreción sudoral, lacrimal, nasal y priapismo, causando en algunos casos la muerte en adultos o niños (Scherone et al. 1957; Scherone 1966).

En la actualidad, el avance en los estudios de los componentes del veneno de la araña Latrodectus mactans se ha realizado en la subespecie euroasiática tredecimguttatus, existiendo ausencia de estudios sobre la composición de las toxinas presentes en el veneno de la araña Latrodectus mactans de Chile o de sus efectos fármaco-citofisiológicos. No obstante, estudios del efecto del extracto de glándula sobre la contractilidad del músculo papilar en corazón de rata demostraron un efecto inótropo positivo (Romero et al. 1996).

Las toxinas excitadoras de origen animal que inducen neuroexocitosis se conocen como neuro- toxinas. Del veneno de la subespecie euroasiática se han identificado al menos tres de estas neurotoxinas de alto peso molecular: (i) la alfa-latrotoxina (a-LTX) de 130 KDa, proteína ácida no glicosilada, que actúa selectivamente sobre terminales nerviosos presinápticos de vertebrados, provocando una liberación masiva de neurotrans- misores por estimulación de la fusión de vesículas sinápticas con la membrana presináptica (Frontali et al. 1972; Grasso 1976; Kiyatkin et al. 1990, 1992); (ii) la alfa-latroinsectotoxina (a-LIT) de 120 KDa, con actividad equivalente sobre insectos (Magazanik et al. 1992); y (iii) la lfa-(125)-latrocrustotoxina (a-LCTX) de 150 KDa, específica para crustáceos (Krasnoperov et al. 1991).

La a-LTX actúa en dosis nanomolares y sus efectos son causados desde el exterior celular. Aunque también es activa en ausencia de calcio, sus acciones son más rápidas en medios que contengan este catión (Hlubek et al. 2000). En modelos aislados de contractilidad de músculo liso de uretra de cerdo, la a-LTX produce relajación estimulada por secreción de mediadores no-adrenérgicos y no-colinérgicos en los terminales nerviosos. Efecto similar se observa en esófago de gato, pero asociado a la liberación de óxido nítrico (NO), péptido intestinal vasoactivo (VIP) y neurotransmisores de las vesículas sinápticas. En este modelo se reporta también un efecto de contracción, atribuido a intermediarios colinérgicos (Werkstrom et al. 1997; Ny et al. 1997). En músculo liso de conducto deferente de rata, la a-LTX produce exocitosis de vesículas con cuerpos densos grandes, que contienen noradrenalina y neuropéptido Y (De Potter et al. 1997).

El presente trabajo tiene por objetivo estudiar el efecto del veneno de Latrodectus mactans de Chile, obtenido de extracto de glándula y de una fracción bioactiva, sobre respuestas de contractilidad en músculo liso y cardiaco, utilizando dos modelos de tejidos aislados: conducto deferente y músculo papilar cardiaco de rata.

MATERIALES Y METODOS

Captura de arañas

La captura de los especímenes de Latrodectus mactans se realizó en los meses de diciembre 1998 y enero 1999 en los sectores de La Peña y Quino, de la VIII y IX Región, de Chile (Figura 1). Los ejemplares son delicadamente inmovilizados con pinzas anatómicas de 30 cm y aislados en cápsulas plásticas (capacidad 150 ml) con su tapa oradada para permitir airear la "jaula". Es importante mencionar que nuestro equipo ha recolectado arañas en la zona mencionada los dos últimos años, realizando siempre un repoblamiento posterior con arañas jóvenes, de modo de no alterar sustancialmente el equilibrio poblacional en el área. Los especímenes son dejados en ayunas por 30 días, mantenidos con agua, para estimular la producción y concentración del veneno en las glándulas.


Figura 1. Sitios de muestreo de la VIII y IX regiones, sector de Quino y La Peña (Santa Bárbara).

Figure 1. Sample sites of the 8th and 9th regions Quino and La Peña sectors (Santa Barbara).

Obtención de veneno

El extracto de glándula venenosa se obtuvo retirando los quelíceros de un total de 65 arañas, previa muerte por inmersión de 1 min. en nitrógeno líquido. Luego se sumergieron unos segundos en buffer fosfato salino (PBS) 0,1 M, pH 7.4, a 4oC y se seccionó la membrana que adhiere a los quelíceros en su base, procediendo a retirarlos. Cada quelícero con su glándula de veneno se depositó en un tubo con el buffer mencionado (25 pares de glándulas por 100 µl de PBS), siendo homogeneizados e inmediatamente centrifugados a 1060 g por 15 min. El sobrenadante alicuotado, que es denominado extracto de glándula (EG), se congeló de inmediato a -20ºC, hasta su utilización.

Registro de contracción isométrica de músculo liso y cardiaco

Se utilizaron 22 ratas Sprague-Dawley machos, de un peso aprox. de 250 g. sacrificadas por decapitación. Se removió rápidamente el corazón y conductos deferentes, para obtener los segmentos de tejidos que se utilizaron en los ensayos experimentales, los que colocados en solución Tyrode (baño de 6 ml) se mantuvieron a 30ºC, conteniendo (concentración en mM): NaCl 137, KCl 5.4, CaCl2 2.7, MgCl2 0.5 NaHCO3 11.9, NaH2PO4 0.45 y glucosa 5.55, a pH 7.4, oxigenando con una mezcla de 95% O2 y 5% CO2. La adición de veneno total o de la fracción purificada en el baño es en volúmenes de 40 µl con micropipeta en concentración proteica final de 20 ng/µl y de 0.5 ng/µl respectivamente.

Los registros de contracción isométrica se realizaron a través de un transductor de fuerza Gilson T 1030 de alta sensibilidad (el extremo inferior se conecta a un portaelectrodo y el superior al transductor), acoplado a un micromanipulador. La preparación de tejido aislado recibe una tensión de reposo basal de 1 g. El transductor de fuerza se conectó a un polígrafo Gilson modelo 5/6H. Luego de un período de estabilización de 60 min, se registró la actividad basal o de control.

La preparación de segmento (3 cm) de conducto deferente se estimuló con una intensidad de 3 a 12 mV, a frecuencia de 5 Hz y 5 ms duración. Se realizaron 6 series experimentales en curvas intensidad-respuesta, en ausencia (control) y 6 series experimentales en presencia de extracto de glándula, más 6 series experimentales en presencia de fracción proteica purificada bioactiva.

El estudio de la respuesta contráctil de músculo papilar de ventrículo izquierdo de rata se realiza en seis series experimentales de segmentos de tejido muscular (aprox. 1 cm) que se conecta al fisiopolígrafo a través de un amplificador IC-MP, para registrar la tensión desarrollada y por interconexión a un amplificador IC-DIFF se obtiene la primera derivada de la función contráctil (dP/dt), como también el valor del tiempo en que se alcanza la máxima tensión desarrollada (t). La preparación se estimuló, con una intensidad del doble de su umbral, a una frecuencia de 5 Hz y 5 ms de duración, en ausencia (control) y en presencia de extracto de glándula de veneno de la Latrodectus mactans de Chile.

Los resultados fueron analizados estadística- mente por el método de ANOVA en el software PRIMER y se graficaron en INPLOT versión 4.0.

Separación de fracción por cromatografía de inmunoafinidad

Para obtener una fracción proteica del veneno de L. mactans chilena, se utilizó un método de separación por inmunoafinidad (Schneider et al. 1982; Scheer & Meldolesi 1985) (ver Anexo I para el procedimiento detallado): proteína A-Sefarosa CL-4B (Pharmacia Biotech), hidratada con buffer borato, fue incubada con 12.5 µg del anticuerpo anti a-LTX, con agitación suave durante 1 hora en cámara fría a 4°C. Luego de centrifugada, se lavó con dietanolamina 0.1 M, pH 8 (DEA) y se resuspendió en 7.5 ml de dimetilsuberi-midato (DMSD, Pierce) preparado en DEA, mezcla que se agitó suavemente durante 45 min a 4°C. A esta matriz sefarosa-proteína A-anticuerpo anti a-LTX, se agregaron 7.5 ml de buffer borato conteniendo 40 µl de EG (de esta dilución se reservaron 500 µl para determinar la concentración de proteínas) con agitación suave. La elución de la fracción ligada al anticuerpo se realizó con 2 ml de glicina 0.2 M, pH 2.7, neutralizando de inmediato con 100 µl de Tris-HCl 1 M, pH 8.0. La fracción se almacenó en alícuotas a -20ºC.

Determinación de contenido de proteínas

Se utilizó la técnica de Lowry (1951) con leves modificaciones. Las lecturas se obtuvieron en un espectrofotómetro Shimadzu. mod. EBA 3S, a 660 nm. y se compararon con una curva de referencia (solución de albúmina sérica bovina) realizada previamente por triplicado.

Análisis electroforético

Se analizó el EG mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS-PAGE)(Laemli 1970), junto con un patrón de pesos moleculares. La técnica se aplicó fundamentalmente de acuerdo al protocolo modificado por Sambrook et al. (1989). Se utilizó un aparato de electroforesis BioRad mod. Mini-Protean II Cell y una fuente de poder BIO-RAD mod. Power-Pac 300. Se usó una solución de acrilamida/bis-acrilamida (BioRad) al 10% . Se depositaron 10 µl de cada muestra en buffer de depósito (ver Anexo I para detalle de todos los buffers utilizados) después de llevarla a ebullición por 5 min. La corrida se realizó a voltaje constante (50 V) por 15 min y 60 V el resto de la corrida. El gel se fijó durante 2 h o toda la noche. La tinción de los geles se realizó con nitrato de plata (Sambrook et al. 1989; Sammons et al. 1981). Se lavaron los geles con etanol 30% tres veces durante 20 min cada vez. A continuación fueron pretratados con 0.2 gr/l de Na2S2O3 x 5 H2O (Sigma) durante 1 min lavados y teñidos con AgNO3 2 gr/l (Merk) más 0.75 ml/l de formaldehído 37%, durante 30 min. Se reveló con Na2CO3 (60 gr/l), HCHO 37% (0.5 ml/l), y Na2S2O3 X 5 H20 (4 mg/l) durante 10 min o hasta aparición de las bandas. Los geles se sumergieron inmediatamente en EDTA 0.05 M (Sigma) para su almacenamiento y posterior digitalización mediante scanner UMAX ASTRA 610 P.

Análisis mediante Dot Immunobinding Assay (DIA)

Para determinar la existencia de epitopes comunes entre la molécula de a-LTX de L. mactans tredecimguttatus (Lmt) y algún componente del EG de L. mactans chilena (Lm), se utilizó la técnica de DIA, fundamentalmente de acuerdo a Hawkes et al. (1982). Membranas de nitrocelulosa fueron sembradas con distintas diluciones de a-LTX de la subespecie euroasiática (Figura 2, segundo, tercer y cuarto recuadro de izquierda a derecha); extracto de glándula de la subespecie Lm (quinto recuadro); y PBS como control negativo (primer recuadro). Brevemente, se usaron tiras de membrana de nitro-celulosa (Inmobilon NC Pure, Sigma) y las muestras (1.5 µl) fueron: (i) a-LTX (Calbiochem) en concentraciones de 0.75, 1.5, 3 (x10-7M). (ii) EG, obtenido como se indicó arriba; y (iii) PBS como control. Luego de bloquear y lavar, se incubó cada NC en concentraciones (µg/ml) de 0.5, 1, 2, 3 del anticuerpo primario (anti a-LTX desarrollado en conejo, Calbiochem). El anticuerpo secundario fue un anti inmunoglobulina de conejo desarrollado en cabra, conjugado a peroxidasa, 1:15.000 (Sigma). Se reveló con tetrahidrocloruro de 3,3' diaminobencidina (DAB) a 0.5 mg/ml en TPBS, más 0.01% de peróxido de hidrógeno y 0.4 mg/ml de cloruro de níquel.

RESULTADOS

Respuesta contráctil isométrica de conducto deferente de rata

Las respuestas de registros típicos de contracción de músculo liso, al aplicar intensidades de estímulos eléctricos crecientes, fueron observadas en las preparaciones aisladas de conducto deferente de rata, como se presentan en la Figura 2. En (a) corresponde a respuesta tónica control, en (b) la contractilidad aumenta en presencia de fracción purificada del veneno de Lm, y en (c) el efecto fásico-tónico basal es incrementado cuando se adiciona al baño extracto de glándula.


Figura 2. Registro típico de contracciones tónicas de conducto deferente de rata inducida por estimulo máximo eléctrico (­=12mV) 5 Hz y 5 ms de duración: (a) respuestas basal control y en presencia de extracto de glándula 20 ng/µl; (b) y por adición de fracción proteica 0.5 ng/µl; (c). calibración 1 g de tensión y velocidad de registro 1 min.

Figure 2. Typical registration of tonic contractions of the rat's vas deferent induced by maximum electric stimulus of (­=12mV) 5Hz and 5 ms duration: (a) control responses and in the presence of glandular extract of 20 ng/µl; (b) and for the addition of protein fractions 0.5 ng/µl; (c) the tension basal of 1 g and registered velocity of 1min.

La reactividad muscular del conducto deferente, en la Figura 3, se muestra en las curvas de porcentaje de respuestas máximas a estímulos eléctricos de intensidad creciente de 3-12 mV, 5 Hz. El valor de Emax obtenido para el control fue de 100±1.3, el que aumenta en presencia de EG (20 ng/µl) a 107.6±0.5, y al adicionar al baño la fracción proteica (0.5 ng/µl) de veneno el valor alcanza a 122.7±2.5. Todas las series experimentales son significativamente diferentes al control (p<0.05). También se determina que el extracto de glándula y la fracción proteica inducen un aumento de la sensibilidad de la curva de intensidad-respuesta determinada por el valor de ED50 del control (mV) que es 7.76±0,11, en tanto la respuesta de sensibilidad en (mV) presencia del EG es 7.33±075 y de la fracción púrificada (mV) es 7.07±0.57. Ambas curvas son significativamente diferentes al control.


Figura 3. Dependencia intensidad-respuesta contráctil del conducto deferente de rata, inducida por estímulos eléctricos variables de 3 a 12 (mV), frecuencia 5 Hz y 5 ms de duración. La respuesta máxima está expresada en porcentaje del efecto fásico-tónico del registro isométrico, control, puntos llenos (n); extracto de glándula, puntos (s); fracción, puntos (`). Cada punto representa la media, y su ES en trazos verticales, de 3 series experimentales con 5 puntos normalizados por ajuste de la función de Hill.

Figure 3. Dependent intensity-contraction response of the rat's vas deferent, induced by variables of electric stimulus of 3 to 12 (mV), duration of 5 Hz and 5 ms frecuency. The maximum response is expressed in a percentage of stage-tonic registered isometric effect. Control, full points (n); glandular extract, points (s) fraction, points (`). Each point represents the medium and the ES in vertical lines of 3 experimental series with 5 normalized points adjusted according to the Hill function.

Respuesta contráctil isométrica de músculo papilar de corazón de rata

En el estudio de los efectos inotrópicos y frecuencia contráctil del músculo papilar de rata, como se muestra en la Tabla I, al adicionar EG (20 ng/µl en concentración final en el baño, 6 ml), aumentaron significativamente los efectos máximos obtenidos para parámetros estudiados (máxima tensión desarrollada, la primera derivada de la función contráctil y tiempo) del músculo papilar aislado de rata y son concordantes con los registros de contractilidad de la máxima tensión y efecto sobre la frecuencia contráctil de este tejido .

Los cambios de las respuestas isométricas obtenidas en la presencia de neurotoxinas fueron reversibles, ya que en ausencia de ellas se observó que la recuperación de los diferentes parámetros no se modificó en relación con los controles.

Tabla I. Efectos inducidos por la adición de extracto de glándula sobre músculo papilar cardiaco de rata.

Table I. Effects induced by the addition of the glandular extract concerning the papillar muscle of the rat.

 


Parámetro Control Efecto max Recuperación (n) p<

MTD (mg/mg) 73.0±0.9 91.0±2.9 75.0±1.7 6 0.05
dP/dt (g/cmxs) 37.0±4.1 49.3±5.2 37.8±5.4 6 0.05
t 000000(ms) 113.0±6.0 105.0±3.8 112.0±5.2 6 0.05

Epitopes comunes entre EG de L. mactans chilena y a-LTX de L. mactans tredecimguttatus

Al utilizar la técnica del DIA para determinar la existencia de epitopes comunes entre algún componente del EG de la subespecie chilena de L. mactans y la a-LTX de la subespecie euroasiática, se observó una reacción positiva con ambas fracciones (Figura 4). Esto demuestra la existencia de epitopes comunes entre las proteínas, por lo cual fue factible utilizar el anticuerpo anti-a-LTX euroasiática en la matriz de inmunoafinidad que separó una fracción del extracto de glándula de Lm con posible actividad a-LTX.


Figura 4. Membranas de nitrocelulosa incubadas con distintas concentraciones de anticuerpo primario (0.5, 1, 2, 3; mg/µl, marcadas de A, B, C, y D). En el recuadro a se observa el control negativo (PBS). En los recuadros b y c se observa el extracto de glándula, diluido 1:2 y 1:4, respectivamente. La a-LTX euroasiática se observa en los recuadros d, e y f, en concentraciones de 0.75; 1.5 y 3 (x10-7 M) respectivamente.

Figure 4. Nitrocelulose membranes incubated with different concentrations of primary antibodies (0.5,1, 2, 3; mg/µl, marked to A, B, C and D). In the chart a negative control can be observed. In the b and c charts the extracted glandula can be observed, diluted 1:2 and 1:4, respectively. The euroasian a-LTX can be observed in charts d, e and f in concentrations of 0,75; 1.5 and 3 (x10-7 M) respectively.

Contenido proteico y bandas electroforéticas

Las alícuotas congeladas, EC y el producto de la separación por inmunoafinidad, fueron estudiadas por el método de Lowry (1951) para determinar su concentración proteica. Los resultados, que se aprecian en la Tabla II, indican la presencia de una alta concentración proteica en el EG (4.99 mg/ml), la mayoría de la cual no se unió a la matriz de inmunoafinidad (3,4 mg/ml), es decir, no presentó epitopes comunes con la a-LTX de Lmt. Sólo 2.95x10-3 mg/ml de proteína se eluyeron de la fracción unida al anticuerpo anti-a-LTX de Lmt. Esta fracción proteica presentó alta actividad tipo a-LTX en los modelos fisiológicos estudiados. En el análisis electroforético (figura 5), se observa para EG un patrón de bandas similar al reportado por Grasso (1976) para el extracto de glándula de la subespecie euroasiática.

Tabla II. Resultados de la determinación de proteínas. Se muestran los valores de concentración de proteínas obtenidas (muestra total de 65 arañas).

Table II. Results of determined proteins. The following demonstrates the values of obtained protein concentrations (total sample of 65 spiders).

 


Muestra Concentración proteica (µg/ml)

Extracto de glándula (EG) 4993.9
G no unido a matriz 3144.4
Fracción proteica 00002.95
Blanco de reactivo ————


Figura 5. Gel de poliacrilamida al 10%, sometido a electroforesis en condiciones denaturantes. Se indica la ubicación de las bandas del marcador de pesos moleculares (94, 67, 43, 30 y 20.1 KDa.). Se observan las bandas correspondientes al extracto de glándula (EG) de la araña Lm, que presentan un patrón similar al obtenido por Grasso (1976) al analizar el EG de la araña Lmt.

Figure 5. Poliacrilamide gel of 10% submitted to electroforesis in denaturing conditions. The location of the zones of the signal lines of the molecular weight is indicated (94, 67, 43, 30 y 20.1 KDa.). The zones corresponding to the glandular extract (EG) of the Lm spider are observed, which present a similar pattern obtained by Grasso (1976) when analysing the EG of the Lmt spider.

DISCUSION

En preparaciones de tejido muscular con inervación intacta, las respuestas a extractos de glándulas y fracciones purificadas de a-LTX del veneno Lmt pueden atribuirse a estímulo de secreción de neurotransmisores en las terminales nerviosas (Grasso 1976; Magazanik et al. 1992; Ny et al. 1997).

En nuestros resultados, la respuesta contráctil del conducto deferente de rata aumentó la actividad de tensión desarrollada en presencia de la fracción purificada, como también su afinidad, lo que nos indica que estamos en presencia de un incremento de la actividad específica en la fracción en comparación con el extracto de glándula. De esto se desprende la necesidad de dilucidar los mecanismos fármaco-receptor utilizando un agonista molecular conocido. Igualmente, nuestro equipo continúa en el trabajo de purificación y caracterización de las fracciones del veneno.

Por otra parte, en músculo papilar cardiaco, en presencia de extracto de glándula, se observó un aumento de respuesta máxima contráctil y de su frecuencia, equivalentes a las respuestas reportadas en la literatura, obtenidas en preparaciones de tejidos aislados en presencia de sustancias simpaticomiméticas con efecto inótropo, los que pueden estar relacionados a un evidente tono simpático dependiente de la presencia de las neurotoxinas en el extracto de glándula y en la fracción purificada (Olson et al. 1995; Frontali 1972; Ny et al. 1997; Werkstrom et al. 1997). Los efectos observados por nuestro equipo podrían deberse a mecanismos similares inducidos por la a-LTX, que generaría posiblemente una exocitosis de terminaciones nerviosas simpáticas que son abundantes en ambos tejidos en estudio.

En modelos aislados de contractilidad de músculo liso de uretra de cerdo, que estudian la fracción a-LTX obtenida de la subespecie euroasiática Latrodectus mactans tredecimguttatus, se reporta un efecto de relajación, el cual se atribuye a una posible secreción de mediadores no-adrenérgicos y no-colinérgicos en los terminales nerviosos (Werkstrom et al. 1997). En músculo liso de esófago de gato, Ny et al. (1997) igualmente observan efecto de relajación inducida por a-LTX, el cual asociaron a la liberación de óxido nítrico (NO), péptido intestinal vasoactivo (VIP) y neurotransmisores de las vesículas sinápticas. Sin embargo, también reportan un efecto de contracción, atribuido a intermediarios colinérgicos. Esto nos permite indicar que el aumento de la sensibilidad de la respuesta contráctil de los diferentes tejidos en nuestros modelos está asociado a mecanismos de membrana y/o intracelulares, directos o mediados por exocitosis de algún neurotransmisor que se active por las neurotoxinas del veneno de la especie Latrodectus mactans de Chile.

El estudio de los venenos animales ponzoñosos demuestra que presentan estructuras moleculares proteicas muy similares en animales que son de los mismos géneros o familias (Scheer et al. 1985; Kiyatkin et al. 1990). Debido a lo anterior, resultó interesante establecer en el presente trabajo la presencia de epitopes comunes entre la a-LTX de la especie euroasiática (preparado comercial) y un componente del veneno de Latrodectus mactans de Chile. Los epitopes comunes encontrados sugieren que la estructura molecular de alguno de los componentes del veneno es similar a la toxina de la araña euroasiática, y por lo tanto su mecanismo de acción puede ser similar. Además, el análisis electroforético del EG de Latrodectus mactans de Chile muestra un patrón similar al del extracto de glándula de Latrodectus mactans euroasiática (Grasso 1976). Sin embargo, una comparación más exhaustiva requerirá la utilización del extracto de glándula de ambas especies en un mismo gel de electroforesis.

Es interesante notar que la actividad específica de la fracción purificada, que modifica el "efecto máximo" en conducto deferente y músculo papilar es mayor que la presentada por el extracto de glándula. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la molécula responsable de parte importante del efecto observado sería precisamente aquella que presenta epitopes comunes con la a-LTX europea.

ANEXO I

Preparación de la matriz de inmunoafinidad

50 mg de proteína A-sefarosa CL-4B (Pharmacia Biotech) liofilizada fueron hidratados con 7.5 ml de buffer borato pH 8.0 (0.1 M NaCl, 20 mM borato), que llamaremos buffer A, durante 30 min. Posteriormente se lavó dos veces en buffer A, centrifugando a 400 g por 5 min. Después del segundo lavado se resuspendió en 7.5 ml de buffer A, con 12.5 µg del anticuerpo anti a-LTX. Se mezcló en rotador con agitación suave durante 1 hora en cámara fría a 4°C. Luego fue centrifugada a 400 g por 5 min. Se lavó la sefarosa con dietanolamina 0.1 M, pH 8 (DEA) centrifugando a 400 g por 5 min a 4°C y luego se resuspendió en 7.5 ml de dimetilsuberimidato (DMSD, Pierce) 20 mM preparado en DEA 0.1 M con pH reajustado a 8.0. La mezcla se agitó suavemente durante 45 min a 4°C. La reacción se detuvo centrifugando a 400 g por 5 min y resuspendiendo en 7.5 ml de etanolamina 20 mM pH 8.0 durante 10 min a 4°C, agitando constantemente. Se lavó dos veces con buffer A centrifugando a 400 g, 5 min cada vez. A esta matriz sefarosa-proteína A-anticuerpo anti a- LTX se agregaron 7.5 ml de buffer borato conteniendo 40 µl de EG (de esta dilución se reservaron 500 µl para determinar concentración proteica) con agitación suave, durante 1 h en cámara fría a 7°C. Luego de completada la incubación, se centrifugó a 400 g por 5 min (el sobrenadante fue recuperado para posteriormente determinar la cantidad de proteína no ligada al anticuerpo). Se lavó la matriz 2 veces en buffer A. La elución de la fracción ligada al anticuerpo se realizó con 2 ml de glicina 0.2M, pH 2.7, neutralizando de inmediato con 100 µL de Tris-HCl 1M, pH 8.0. La fracción aislada se almacenó en alícuotas a -20ºC.

Buffers de electroforesis

Buffer de depósito: TRIS HCl 50 mM, pH 6.8, Dithiotreitol 100 mM, SDS 2%, Azul de bromofenol 0.1%, y Glicerol 10%, con DTT (dihitrioteitol)1M.

Buffer de corrida: TRIS-Glicina 0.5 M, pH 8.8 con 10% SDS.

Fijador de gel: etanol 30%, acido acético 12% y 0.5 ml/l de formaldehído al 37%.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos los financiamientos recibidos de la Dirección de Investigación de la Universidad de la Frontera (DIUFRO), Proyecto 9731 y del Centro de Biotecnología de la Reproducción (CEBOIR) perteneciente al proyecto de Mejoramiento de la Calidad de la Educación Superior MECE-SUP98 UFRO "Programa fortalecimiento de la capacidad científica tecnológica y productiva regional".

Fecha de recepción: 03.01.2000
Fecha de aceptación: 11.10.2000

BIBLIOGRAFIA

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