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Gayana. Botánica

versión On-line ISSN 0717-6643

Gayana Bot. vol.72 no.1 Concepción jun. 2015

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-66432015000100002 

ARTICULOS REGULARES

 

Enraizamiento in vitro y ex vitro de microtallos de Ugni molinae Turcz., una especie nativa de Chile

In vitro and ex vitro rooting of Ugni molinae Turcz. microshoots, a native species to Chile

 

MARIO RODRÍGUEZ BERAUD1*, RUBÉN CARRILLO LÓPEZ2, MANUEL CHACÓN FUENTES1, NELSON HORMAZÁBAL VÁSQUEZ1, JOCELYNE TAMPE PÉREZ1 & RICARDO TIGHE NEIRA1

1Escuela de Agronomía, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco, Casilla 15-D, Temuco, Chile.
2Departamento de Ciencias Agronómicas y Recursos Naturales, Facultad de Ciencias Agropecuarias y Forestales, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

*E-mail: marodrig@uct.cl


RESUMEN

Con el objetivo de evaluar el enraizamiento in vitro y ex vitro de microtallos de dos clones de Ugni molinae, se establecieron dos ensayos. En el experimento de enraizamiento in vitro se contrastaron nueve tratamientos producto de la combinación de tres concentraciones de medio Murashige y Skoog (MS) (1, ½ y ¼ de los macronutrientes diluidos) y tres de ácido 3-indolbutírico (AIB) (0, 1 y 2 µM). En tanto, para el ensayo de enraizamiento ex vitro se contrastaron cuatro tratamientos correspondientes a las concentraciones de 0; 4,9; 9,8 y 19,7 mM de AIB. Después de 30 días se evaluó la supervivencia, enraizamiento, longitud de raíz y número de raíces por explante. El tratamiento que logró el mayor enraizamiento difirió entre ambos clones. En condiciones in vitro el Clon 1 obtuvo un promedio de enraizamiento de 97% con ½ MS + 1 µM de AIB, mientras que el Clon 2 obtuvo un 93% con ¼ de MS + 2 µM de AIB. Nuestros resultados indican que la disminución de sales en el medio de cultivo MS y la adición de AIB favorece el enraizamiento. Con respecto a las condiciones ex vitro, el Clon 1 no respondió a las aplicaciones de AIB, en cambio en el Clon 2, el AIB promovió el enraizamiento a la concentración de 19,7 mM, alcanzando porcentajes de 90 y 85%, respectivamente. En virtud de los resultados obtenidos, se sugiere un enraizamiento ex vitro para los clones 1 y 2, para evitar los costos asociados al enraizamiento in vitro, ya que independiente del sistema utilizado, ambos clones obtuvieron enraizamientos iguales o superiores a un 85% en el mejor de sus tratamientos.

Palabras clave: Ácido 3-indolbutírico, micropropagación, Myrtaceae, rizogénesis, auxina.


ABSTRACT

Two trials were established to evaluate the in vitro and ex vitro rooting of selected microshoots of two selected clones of Ugni molinae. In the in vitro experiment, nine treatments were compared, combination of three concentrations of Murashige and Skoog medium (MS) (1, ½ and ¼ strength macronutrients) and three concentration of indole 3-butyric acid (IBA, at 0, 1 and 2 µM). In the ex vitro assay we established for IBA four concentrations (0; 4.9; 9.8 and 19.7 mM). After 30 days total survival, rooting percentage, root length and number of roots per explants were evaluated. Both clones responded differently to the treatments used. Under in vitro conditions, Clone 1 had an average of 97% rooting at ½ MS + 1 µM IBA, whereas Clone 2 obtained a 93% of rooting with ¼ MS + 2 µM IBA. Our results indicate that the decrease in the strength of MS medium and the addition of IBA promotes rooting. With regard to ex vitro conditions, the Clone 1 did not respond to IBA applications, while in Clone 2, IBA promoted the rooting at the concentration of 19.7 mM, with percentages of 90 and 85%, respectively. Considering these results, it is generally recommended to use the ex vitro rooting system because both clones were able to obtain the same high percentage rooting (above 85%) in this system. Ex vitro propagation will also safe costs.

Keywords: Indole 3-butyric acid, micropropagation, Myrtaceae, rhizogenesis, auxin.


 

INTRODUCCIÓN

Ugni molinae Turcz. (Myrtaceae) es un arbusto de hoja persistente, conocido como murta o murtilla, nativo de Chile, de ramas erectas comprimidas y vellosas cuando son nuevas. Esta especie se distribuye entre las regiones del Maule y Aysén, particularmente en la Cordillera de la Costa y parte de la precordillera Andina en bordes de camino y claros del bosque (Andrade et al. 2009, Riedemann & Aldunate 2009). Su fruto corresponde a una baya globosa, aromática, de sabor agradable, que dependiendo de los ecotipos presentan distintas coloraciones entre el rojo oscuro y el blanco, incluyendo el amarillo y púrpura (Rodríguez 2000, Riedemann & Aldunate 2009). A la murtilla se le atribuyen numerosas características medicinales como efectos analgésicos, anti-inflamatorios, astringentes, actividad antimicrobiana y antioxidante (Avello & Pastene 2005, Rubilar et al. 2006, Suwalsky et al. 2006, Delporte et al. 2007, Suwalsky et al. 2007, Avello et al. 2009), propiedades que han impulsado la incorporación de la murtilla a un sistema de cultivo comercial, a través de un proceso de selección y determinación de condiciones que optimicen la producción de su materia prima, tales como métodos de propagación y selección de ecotipos (Rodríguez 2000).

La formación de raíces adventicias se divide en cuatro etapas: inducción, iniciación, formación de primordios de raíces y elongación. Es un proceso inducido y regulado por factores externos como temperatura, luz y composición del medio de cultivo e internos como producción endógena de fitohormonas, carbohidratos y compuestos fenólicos (Pop et al. 2011).

En la micropropagación de plantas, la fase de aclimatación puede ser crítica, donde el enraizamiento de los microtallos juega un rol fundamental. El enraizamiento in vitro es seguido por la aclimatación de plantas en invernadero, y se realiza en plantas de difícil enraizamiento ex vitro (Sathyanarayana & Barghese 2007). Los microtallos también pueden ser enraizados ex vitro de forma simultánea con la aclimatación en condiciones no asépticas y en sustratos generalmente en base a turba con perlita o arena (Smith 2012). La etapa crítica ocurre entre el trasplante del microtallo y el inicio de emisión de raíces, ya que existe un desbalance hídrico entre la transpiración y absorción de agua. Para acelerar este proceso se recurre a la adición de auxinas, entre éstas el ácido indol 3-butírico (AIB) (Rai et al. 2009), ácido indol 3-acético (AIA) (Jain & Babbar 2000) y ácido naftalenacético (ANA) (Shah et al. 2008).

Otro aspecto importante son los reguladores de crecimiento utilizados en la etapa anterior (multiplicación de los microtallos); las citoquininas y giberelinas utilizadas ampliamente en el desarrollo de brotes axilares, se han descrito también como inhibidores del enraizamiento (Pop et al. 2011, Saini et al. 2013). Por otra parte, niveles altos de bencilaminopurina (BAP) se manifiestan a menudo en brotes hiperhídricos con problemas en la fase de aclimatación (Rodríguez 2011).

Para el enraizamiento in vitro de Mirtáceas se ha utilizado el medio MS con AIB en Eucalyptus globulus Labill. (Bennet et al. 1994), híbridos de Leptospermum (Seelye et al. 2001), Syzygium francissi (F.M. Bailey) L.A.S. Johnson (Shatnawi et al. 2004), Metrosideros excelsa Gaertn. (Iapichino & Airo 2008), y Psidium guajava L. (Rai et al. 2009), entre otras especies. Otra estrategia de enraizamiento es la disminución de la concentración de sales del medio diluyéndolas, por ejemplo a la mitad, tal es el caso del medio MS en la micropropagación de S. alternifolium (Sha Valli Khan et al. 1999), E. tereticornis (Sharma & Ramamurth 2000), P. guajava (Singh et al. 2002), o la utilización de medios de cultivos con menor concentración de sales que el MS como el Woody Plant Medium (WPM) en Feijoa sellowiana Berg (Oltramari et al. 2000), P. guajava (Meghwal et al. 2010), ½ WPM en P. salutare (Sotolongo et al. 2003), medio de De Fossard (FS) en E. globulus (Trindade & Pais 1997), E. nitens (Gomes & Canhoto 2003), medio de Gamborg (B5) en E. urophylla y E. grandis (Martínez et al. 2005), o medio de Knop en S. cuminii (Jain & Babbar 2000). En otras ocasiones ha resultado una combinación de auxinas tales como AIB y ANA o AIB y AIA ha resultado beneficioso sobre el enraizamiento de microtallos de P. guajava (Fuenmayor & Montero 1997, Zamir et al. 2007). De acuerdo a lo anteriormente expuesto, la hipótesis de trabajo es que la adición de AIB aplicado para el enraizamiento ex vitro y una combinación de AIB con un medio MS diluido en el enraizamiento in vitro promueve la rizogénesis de microtallos de murtilla. Para dar cumplimiento a esta hipótesis se plantea como objetivo determinar la mejor combinación entre las concentraciones del medio MS y AIB, que permitan los mayores enraizamientos in vitro como también evaluar la respuesta rizogénica ex vitro con diferentes concentraciones de AIB para cada uno de los clones seleccionados.

MATERIALES Y METODOS

MATERIAL VEGETAL

Se utilizaron dos clones de murtilla, Clon 1 y Clon 2 pertenecientes a una selección de ecotipos. El Clon 1 de bayas rojas procede de la zona costera en la Comuna de Teodoro Schmidt (latitud 38°45’ S, longitud 73°00’ O), Región de La Araucanía, y el Clon 2 de bayas amarillas proviene de la localidad costera de Niebla (latitud 39°51’ S, longitud 73°24’ O), comuna de Valdivia, Región de Los Ríos. Los microtallos fueron obtenidos a partir de cinco ciclos de subcultivos de segmentos uninodales en un medio de multiplicación Murashige & Skoog (1962) (MS) con un pH ajustado a 5,8, suplementado con 1 µM BA, 30 g L-1 de sacarosa y 7 g L-1 de agar microbiológico (Merck®). Para el enraizamiento se cortaron brotes apicales de aproximadamente 15 mm sin callo basal.

CONDICIONES DE CULTIVO

Los microtallos de ambos ensayos permanecieron por 30 días en una cámara de incubación a 25 ± 2°C, con luz fluorescente blanca, 50 µmol m-2 s-1, y un fotoperiodo de 16 h luz. En el ensayo ex vitro se realizaron dos riegos con 65 mL de agua destilada estéril por caja, al comienzo y a los 15 días de la siembra.

ENSAYO 1. ENRAIZAMIENTO IN VITRO

Se realizaron nueve tratamientos producto de la combinación de tres concentraciones de MS (1, ½ y ¼ de los macronutrientes diluidos) y tres concentraciones de AIB (0, 1 y 2 µM), suplementado con 30 g L-1 de sacarosa y gelificado con 7 g L-1 de agar microbiológico. El pH fue ajustado a 5,8 con
hidróxido de potasio 1,0 N (KOH) y de ácido clorhídrico 1,0 N (HCl). Cada microtallo fue incubado en un frasco de 40 mL con 8 mL de medio de cultivo cada uno.

ENSAYO 2. ENRAIZAMIENTO EX VITRO

Se realizaron cuatro tratamientos correspondientes a las concentraciones de 0; 4,9; 9,8 y 19,7 mM de AIB. Los microtallos fueron tratados en su base con una solución hidro-alcohólica 50%, pH 4,7 de AIB por 10 segundos. Se utilizó un sustrato de turba+perlita 2:1 v/v contenido en cajas plásticas transparentes (18 x 5,5 cm), a razón de 430 mL por caja con 20 microtallos cada uno.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar para todos los tratamientos. La unidad experimental correspondió a 20 microtallos con tres repeticiones por tratamiento. Los porcentajes fueron transformados al arcoseno de la raíz cuadrada del porcentaje dividido por 100. Los datos fueron analizados utilizando el programa estadístico SPSS versión 15. Se aplicó la prueba de normalidad (Shapiro-Wilk) y se analizó la homogeneidad de varianzas (estadístico de Levene). Se utilizó el análisis de varianza ANDEVA y para las diferencias significativas entre promedios la prueba de Duncan (p≤0,05). Los resultados se expresan como promedios ± error estándar de tres repeticiones por tratamiento.

RESULTADOS

ENRAIZAMIENTO IN VITRO

La interacción entre el medio MS y AIB fue significativa para todas las variables estudiadas en ambos clones (Tabla I). La supervivencia de los microtallos fue de 100% para todos los tratamientos en ambos clones. En general, los promedios de enraizamiento fueron más elevados en el Clon 1. Después de 30 días de enraizamiento, el Clon 1 alcanzó un promedio máximo de 97% de enraizamiento con ½ MS y 1 µM de AIB, en cambio el Clon 2 un 93% con ¼ MS y 2 µM de AIB; estas combinaciones fueron significativamente superiores (p≤0,05) a los tratamientos con MS completo en cualquier combinación con AIB para ambos clones. Los valores más bajos, 73 y 67%, se encontraron en los tratamientos de 1 MS sin AIB para el Clon 1 y 2, respectivamente. Por otra parte, mayores concentraciones de AIB aumentaron el número de raíces, encontrándose en los tratamientos de ½ MS con 1 y 2 µM de AIB los valores significativamente más altos en ambos clones. El valor promedio de longitud de las raíces osciló entre 18,9 y 12,4 mm para el Clon 1 y 16,9 y 12,3 mm para el Clon 2, observándose los valores menores en los tratamientos con 1 MS en presencia de AIB.

ENRAIZAMIENTO EX VITRO

La supervivencia y enraizamiento de los microtallos fue mayor en el Clon 1 que en el Clon 2, 88 y 83% vs. 79 y 75% respectivamente. No obstante, en el Clon 1 no se observaron respuestas significativas (p≤0,05) por la presencia de AIB como lo hizo respecto a esta variable el Clon 2 (Tabla II). La concentración de 19,7 mM de AIB permitió el mayor porcentaje de enraizamiento y número de raíces para ambos clones, lo cual se relacionó con una alta supervivencia. Por otra parte, la menor supervivencia de los microtallos del Clon 2 (68%) es reflejo de su bajo nivel de enraizamiento. La mayor longitud de raíces en el Clon 1 se observó con el tratamiento sin AIB, los tallos enraizados de este tratamiento se caracterizaron por poseer pocas raíces y largas. En el Clon 2 no hubo una respuesta significativa respecto a esta variable.

Tanto en el enraizamiento in vitro como ex vitro se formó un callo basal a partir del cual se inició la emisión de raíces. En general, los microtallos enraizados ex vitro mostraron un menor número de raíces principales pero un mayor desarrollo de raíces laterales, los microtallos enraizados in vitro lucían raíces más traslúcidas, con pelos radicales, brotes más desarrollados y una mayor cantidad de hojas.

DISCUSIÓN

El Clon 1 mostró un mayor enraizamiento ya sea en condiciones in vitro como ex vitro, no obstante e independiente de la técnica aplicada y del clon, los mejores tratamientos obtuvieron valores de enraizamiento superiores al 85%, lo cual es considerado muy bueno para una especie que se quiera propagar. En virtud de estos resultados se sugiere para esta especie hacer el enraizamiento ex vitro debido a que el enraizamiento in vitro requiere de mayores costos y tiempo de aclimatación (Sathyanarayana & Barghese 2007). En general, dependiendo de la especie, los costos del enraizamiento in vitro se estiman entre un 35 a 50% del total de los costos de la micropropagación (Leva 2011) e incluso más. Al respecto, Ranaweera et al. (2013), en Camellia sinensis calcularon un 71% de reducción del costo de la planta micropropagada al utilizar el enraizamiento ex vitro vs. el in vitro. Si bien la ventaja inicial de obtener plantas más desarrolladas al final del enraizamiento in vitro es evidente, posteriormente durante la aclimatación éstas presentan un mayor estrés, por lo que detienen temporalmente su crecimiento, anulando su ventaja inicial respecto a las enraizadas ex vitro. Además, las raíces formadas in vitro usualmente tienen poca conexión vascular con el brote y la captación de agua es baja, por lo tanto las raíces formadas in vitro no son comparables desde el punto de vista funcional a aquéllas generadas ex vitro (Trindade & País 1997, Nourissier & Monteuuis 2008).

 

TABLA I. Efecto de diferentes concentraciones de ácido 3-indol butírico (AIB) y dilución de macrosales (MS) sobre la rizogénesis de microtallos de dos clones de Ugni molinae bajo condiciones in vitro.

TABLE I. Effect of different concentrations of indole 3-butyric acid (IBA) and dilution of macro salts (MS) on rhizogenesis of microshoots of two Uingi molinae clones, under in vitro conditions.

 

TABLA II. Efecto de diferentes concentraciones de ácido 3-indol butírico (AIB) sobre la rizogénesis de microtallos de dos clones Ugni molinae bajo condiciones ex vitro.

TABLE II. Effect of different concentrations of indole 3-butyric acid (IBA) on the rhizogenesis of microshoots of two Ugni molinae clones, under ex vitro conditions.

 

El tratamiento óptimo para el enraizamiento difiere entre ambos clones. En condiciones in vitro el Clon 1 obtiene el promedio máximo de enraizamiento con ½ MS + 1 µM de AIB, el Clon 2 lo hace con ¼ de MS + 2 µM de AIB, por otra parte, bajo condiciones ex vitro el Clon 1 no responde a las aplicaciones de AIB, en cambio en el Clon 2 el AIB promueve el enraizamiento. Por lo anterior, se puede atribuir una respuesta genética dependiente del clon. La diferencia en la respuesta rizogénica se puede encontrar a nivel de especies, variedades e incluso entre clones de una misma especie (Mankessi et al. 2009). Al respecto Doll et al. (2012) encontraron, después de tres meses, diferencias significativas en el enraizamiento de estacas de U. molinae (89 y 43%) entre murtillas procedentes de la Cordillera de los Andes vs. la Cordillera de la Costa. La adición de AIB a las estacas mejoró el enraizamiento pero mantuvo las diferencias entre ambas procedencias. Eucalyptus globulus es una de las especies que presenta dificultades de enraizamiento dentro de su género (Fett-Neto et al. 2001), incluso ésta puede diferir entre diversos clones (Trindade & País 1997). Al respecto, Borges et al. (2011) encontraron diferencias en el enraizamiento entre clones híbridos de E. urophylla x E. globulus y E. grandis x E. globulus, mostrando variaciones que en muchos casos superaban el 50%. El conocimiento de la habilidad rizogénica de un clon es de enorme interés para la producción comercial y muchas veces es el factor que determina su disponibilidad en el mercado. La facilidad de enraizamiento de la murtilla especialmente del Clon 1, el cual no tiene diferencias significativas entre los tratamientos ex vitro con o sin AIB, hace suponer que este clon posee los contenidos endógenos de auxinas suficientes para desencadenar una respuesta rizogénica adecuada (Simon & Petrásek 2011). No obstante, la aplicación de 19,7 mM de AIB aumentó el número de raíces por explante, lo cual debe ser considerado para la supervivencia y desarrollo del sistema radical de la planta en sus posteriores etapas de desarrollo en vivero.

En mirtáceas, el AIB ha sido la principal hormona utilizada para el enraizamiento de microtallos (Singh et al. 2002, Shatnawi et al. 2004, Rai et al. 2009). El AIB es más estable y efectivo que AIA para la inducción de raíces laterales, además puede ser convertido a AIA en los peroxisomas por β-oxidación (Zolman et al. 2000, Woodward & Bartel 2005). Según Pop et al. (2011), el AIB puede potenciarse con los contenidos de AIA endógeno, en este caso puede ser explicada por una mayor estabilidad, diferentes metabolismos, diferencia en el transporte y la conversión del AIB en AIA, esta interacción AIB-AIA difiere entre las especies, lo que también puede reflejarse entre clones distintos de una misma especie (Ludwig-Müller et al. 2005, Saini et al. 2013).

La dilución del medio MS provocó, en general, un mayor enraizamiento in vitro al compararlo con los tratamientos de MS completo, esta estrategia es de uso frecuente para estimular el enraizamiento in vitro (Nourissier & Monteuuis 2008, Shah et al. 2008). La salinidad del medio de cultivo modifica la capacidad de adsorción del gel y con ello la disponibilidad de sus componentes, entre ellos las auxinas exógenas (Sathyanarayana & Barghese 2007).

La murtilla responde al enraizamiento in vitro con bajas concentraciones de AIB en comparación a otras mirtáceas como Syzygium cuminii (Jain & Babbar 2000), Feijoa sellowiana (Oltramari et al. 2000), Eucalyptus nitens (Gomes & Canhoto 2003), S. francissi (Shatnawi et al. 2004) y Psidium guajava (Martínez et al. 2005) y su incremento de 1 a 2 µM no produce cambios significativos. Probablemente mayores concentraciones de AIB disminuyan el porcentaje de enraizamiento como lo observado por Nourissier & Monteuuis (2008), quienes encontraron que al aumentar la concentración de 5 a 12,5 µM de AIB se redujo significativamente el porcentaje de enraizamiento en dos de los cuatro clones híbridos estudiados de E. urophylla x E. grandis.

Al final del ensayo, las plantas enraizadas in vitro exhibían un mayor desarrollo en longitud del tallo, un incipiente desarrollo de brotes laterales y un mayor número de raíces, las cuales eran de aspecto translúcido y frágil. Por otra parte, las plantas enraizadas ex vitro mostraban signos de estrés, especialmente por la caída de algunas hojas basales durante las primeras dos semanas de enraizamiento, probablemente por la falta de agua. El estrés osmótico induce un incremento de los niveles endógenos de ácido abscísico (ABA) y como consecuencia la caída de hojas (Fujita et al. 2011). Lo anterior sugiere que es probable mejorar la técnica empleada cortando un par de hojas basales previo al enraizamiento ex vitro. Independiente del tratamiento utilizado, todos los microtallos enraizados formaron un callo basal de donde emitían raíces adventicias. La formación de callo basal es muy frecuente en esquejes y es provocado por una mayor concentración de auxinas en la zona de la herida (Pop et al. 2011), sin embargo las raíces adventicias en otras especies pueden ser emitidas desde puntos del tallo distinto al callo basal, incluso el callo basal se puede desarrollar después de la emisión de las raíces. Al respecto, Štefančič et al. (2005) observaron en portainjertos de Prunus ‘GiSelA5’ que los sistemas radiculares desarrollados a partir de un callo basal eran de menor calidad. En el enraizamiento, un callo basal grande no es una condición deseable y su tamaño es menor cuando se utiliza AIB en comparación a otras auxinas como ANA o AIA (Metivier et al. 2007).

CONCLUSIONES

Los microtallos de murtilla derivados del cultivo in vitro poseen una alta habilidad rizogénica, por lo que no es necesario su enraizamiento in vitro, debido a los costos involucrados. El uso de AIB para las condiciones ex vitro es aconsejable, ya que promueve el enraizamiento y cuando no lo hace al menos incrementa el número de raíces. La respuesta dependerá del genotipo del Clon.

 

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Recibido: 14.05.14
Aceptado: 16.09.14

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