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Revista chilena de enfermedades respiratorias

On-line version ISSN 0717-7348

Rev. chil. enferm. respir. vol.24 no.1 Santiago Mar. 2008

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-73482008000100002 

Rev Chil Enf Respir 2008; 24: 7-14

TRABAJO ORIGINAL

 

Instilación intratraqueal de elastasa en la rata: Cambios electroforéticos de la α1-AT-antitripsina en el lavado broncoalveolar

Intratracheal instillation of elastase in the rat: Electrophoretical changes of alphal-antitrypsin in bronchoalveolar lavage fluid

 

ANDREA VECCHIOLA C.*, ALEJANDRO RAMÍREZ M.*, ANDREA VILLAGRÁN T.*, CAROLINA SERRANO H.*, LEONEL LIBERONA T.*, CLAUDIA SÁEZ S.* y GISELLA BORZONE T.*

* Departamento de Enfermedades Respiratorias y Centro de Investigaciones Médicas, Pontificia Universidad Católica de Chile.

Dirección para correspondencia


Introduction: Endogenous alphal-antitrypsin ( α1-AT) is the main inhibitor of the intratracheally instilled elastase in experimental animals. Objective: To evaluate by electrophoresis and immunodetection using western blot analysis, the different forms of α1-AT in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of Sprague Dawley rats after intratracheal instillation of elastase, with the hypothesis that the previously observed increment in antielastase activity is due to high levels of active α1-AT. Results: In the first hours after elastase instillation the concentration of α1-AT increases more than seven times due to an increase in alveolar-capillary permeability. α1-AT in BAIF is found as the native protein (~ 52 kDa), as complexes of different molecular sizes (> 75 kDa and > 100 kDa) and as a proteolytic product (< 40 kDa). Conclusion: In spite of a high proportion of α1-AT in the inactive form as part of different complexes, the increase in alveolar-capillary permeability after elastase treatment contributes to maintain high levels of active α1-AT. These results could be of importance in other inflammatory lung processes.

Keywords: antiprotease, α1-AT, diffuse lung damage, elastase, electrophoresis.

Resumen

Introducción: la antiproteasa alfa 1-antitripsina ( α1-AT) constituye el principal inhibidor endógeno de la elastasa instilada por vía intratraqueal en modelos experimentales. Objetivo: Evaluar mediante electroforesis e inmunodetección por western blot, las distintas formas en que se encuentra la α1-AT en el lavado broncoalveolar (IBA) de ratas Sprague Dawley después de la instilación de elastasa, con la hipótesis de que el aumento en la actividad antielastasa previamente encontrada se acompaña de niveles altos de α1-AT activa. Resultados: En las primeras horas post-elastasa la concentración de α1-AT en el IBA aumenta más de 7 veces, debido al aumento de la permeabilidad alvéolo-capilar, encontrándose tanto como proteína nativa (~ 52 kDa), como parte de complejos de mayor tamaño (> 75 kDa y > 100 kDa) y como producto de proteólisis (< 40 kDa). Conclusión: A pesar de existir una alta proporción de α1-AT inactiva formando complejos, el aumento de la permeabilidad alvéolo-capilar contribuye a mantener niveles altos de α1-AT activa. Estos resultados podrían ser extrapolables a distintos procesos inflamatorios pulmonares.

Palabras clave: antiproteasa, α1-AT, daño pulmonar difuso, elastasa, electroforesis.


Introducción

La principal defensa contra las proteasas capaces de destruir la matriz extracelular del pulmón radica en la antiproteasa alfa1-antitripsina ( α1-AT), una glicoproteína de 52 kDa, que si bien es capaz de inhibir a distintas proteasas, es altamente específica para la elastasa liberada desde los macrófagos y polimorfonucleares neutró-filos en distintos tipos de procesos inflamatorios pulmonares agudos y crónicos13. Más del 90% de la elastasa producida por estas células en el pulmón es inhibida por esta antiproteasa4. Dada su alta constante de asociación en su reacción con la elastasa, forma complejos estables en una "reacción suicida" que impide el daño elastolítico de los componentes de la matriz extracelular5.

Diversos estudios han mostrado que la deficiencia de α1-AT se acompaña de una inadecuada protección del tracto respiratorio inferior contra las proteasas, lo que favorece la destrucción de los tabiques alveolares6. En animales de experimentación por otra parte, la instilación intratraqueal (IT) de elastasa ha sido ampliamente utilizada para estudiar las consecuencias de un exceso de proteasas las que sobrepasan a la principal defensa antielastasa, favoreciendo la destrucción tisular7.

En un estudio previo, utilizando el modelo de instilación IT de elastasa en la rata Sprague Dawley, encontramos que la actividad de ccl-AT en el lavado broncoalveolar (LBA) no disminuye como se esperaría debido a la formación de complejos con la elastasa instilada, sino que aumenta8. Basado en lo anterior, nuestra hipótesis es que si bien la α1-AT existente en el pulmón es utilizada en la formación de complejos elastasa- α1-AT, existen mecanismos que favorecen la llegada de nueva α1-AT desde la circulación a los espacios aéreos, aumentando su concentración y actividad.

Nuestro objetivo fue estudiar en el LBA del pulmón de la rata a distintos tiempos después de la instilación IT de elastasa, la concentración de α1-AT y las formas en que ésta se encuentra, utilizando técnicas de electroforesis e inmuno-detección. El conocimiento de la dinámica de los cambios experimentados por la α1-AT en el pulmón frente a una sobrecarga de proteasas contribuirá a una mejor comprensión de la fisiopatología de diversas enfermedades pulmonares en las cuales participa la liberación de proteasas.

Método

Modelo experimental de instilación de elastasa: El estudio se realizó de acuerdo a las normas del Comité de Ética para el trabajo con animales de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Ratas Sprague-Dawley machos de 270 ± 10 g de peso recibieron una dosis única de elastasa pancreática porcina (Sigma, 0,55 U/100 g de peso corporal en 0,5 mi de NaCl 0,15 M) por vía IT. La solución de elastasa se preparó bajo condiciones estériles, inmediatamente antes de su administración IT con una aguja hipodér-mica 25G bajo anestesia con hidrato de cloral (45 mg/100 g de peso corporal). Para ello se realizó una pequeña incisión en la piel del cuello para separar los músculos cervicales y exponer la tráquea. Luego del cierre de la incisión y de la recuperación anestésica, los animales fueron mantenidos en el vivero, con un régimen de luz de 12 horas diarias y alimentados ad libitum con alimento estándar para roedores. Se estudiaron cuatro grupos de animales (4 horas, 24 horas, 4 días, 7 días; n = 5 por grupo, descontando una letalidad del 20%). El grupo control (n = 5) estuvo constituido por animales sin intervención, mantenidos en similares condiciones que los grupos experimentales y anestesiados al momento del sacrificio.

Lavado Broncoalveolar: Inmediatamente después del sacrificio bajo anestesia con hidrato de cloral (45 mg/100 g de peso), los pulmones fueron resecados en bloque. El pulmón derecho fijado en formalina se utilizó para análisis histológico mientras que el pulmón izquierdo se utilizó para el LBA. Tres alícuotas de 2 mi de solución salina 0,15 M, fueron instiladas, inmediatamente aspiradas, mezcladas y almacenadas a -80 °C hasta su utilización en la determinación del contenido total de proteínas por el método de Bradford9 y en la inmunodetección de α1-AT por western blot.

Electroforesis para la separación de las proteínas del lavado e inmunodetección de α1-AT: Con el objetivo de evidenciar las formas electroforéticas de α1-AT utilizamos geles de poli-acrilamida al 7,5% tanto: a) en condiciones nativas (en ausencia de SDS y P-mercaptoe-tanol), lo que permite mantener la esctructura tridimensional de las proteínas que se intenta separar, como b) en condiciones desnaturantes que hacen desaparecer las estructuras terciarias y los complejos de α1-AT. Cada uno de los geles contenía cinco muestras de 20 uL de LBA sin diluir (una muestra control y una muestra correspondiente a cada uno de los tiempos post-elastasa) constituyendo un set. Concluida la electroforesis, las proteínas de algunos geles fueron teñidas con azul de Coomasie (Coomasie R-250 en 10%-ácido acético/45%-metanol), mientras las restantes fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa para la inmunodetección de α1-AT.

Inmunodetección de α1-AT10. Luego de la separación de las proteínas mediante electroforesis, éstas fueron inmovilizadas en membranas de nitrocelulosa (PIERCE, tamaño de poro 0,45 um), las cuales fueron luego incubadas con una solución de gelatina 1% en Tween-PBS previo a la reacción con el anticuerpo primario policlonal anti α1-AT humana, (SIGMA, USA; con reacción cruzada para α1-AT de rata, dilución 1: 1.000) y el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rabanito (PIERCE, Rockford, USA; dilución 1: 5.000). Se utilizó quimiolumi-niscencia (Amersham, Oakville, ON, Canadá) para revelar el perfil de las bandas obtenidas. La intensidad de las bandas se cuantificó mediante densitometría utilizando el programa Image J de procesamiento de imágenes desarrollado en The National Institutes of Health, USA.

Análisis estadístico: Los resultados fueron examinados utilizando análisis de varianza (ANOVA) y el test post-hoc de Tukey12. Un valor de p < de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Resultados

Evidencias de aumento de la permeabilidad alvéolo-capilar luego de la instilación de elastasa.

La Figura 1 muestra, en un gel representativo teñido con azul de Coomasie, el curso temporal de los cambios en la concentración de distintas proteínas en el lavado (LBA) después de la instilación de elastasa, en comparación con una muestra de suero (S) del mismo animal del cual se obtuvo el LBA. Es posible observar que en el grupo control la muestra de suero (S) y de lavado (LBA) difieren en el contenido y movilidad de las proteínas. A las cuatro horas después de la instilación IT de elastasa, el LBA presenta un cambio en el perfil de las proteínas, el que a las 24 horas es muy similar al del suero, como reflejo de un gran aumento de la permeabilidad alvéolo-capilar. Por otra parte, a los siete días, el perfil de las proteínas del LBA difiere del perfil del suero y es similar al del LBA basal.


En la Tabla 1 se muestra la concentración de proteínas totales en el LBA a los distintos tiempos, medida por el método de Bradford (en µg x ml-1). Se puede inferir que el aumento de permeabilidad alvéolo-capilar es evidente, aunque no estadísticamente significativo, ya a las 4 horas post elastasa, dado el aumento de 4 veces en la concentración de proteínas totales en comparación con el grupo control. La concentración de proteínas en el LBA alcanza un máximo de 7 veces el valor del control a las 24 horas (p < 0,001) y retorna a los niveles básales a los 4 y 7 días.


Aumento de la concentración de α1-AT en el LBA post-instilación de elastasa en relación al aumento de la permeabilidad alvéolo-capilar.

La Figura 2 ilustra la inmuno-reactividad encontrada frente al anticuerpo anti α1-AT de las muestras y del LBA transferidas a una membrana de nitrocelulosa después de una electroforesis en condiciones desnaturantes. En A, el gráfico muestra los niveles de α1-AT inmuno-reactiva en el LBA obtenidos mediante análisis densito-métrico a distintos tiempos después de la instilación de elastasa y expresados como veces de aumento en relación al control. En B se muestra un gel representativo, en el que es posible observar un aumento en la intensidad de la banda única de 52 kDa correspondiente al peso molecular descrito para la α1-AT. Este aumento es evidente desde las 4 horas post-elastasa, y alcanza un máximo de 7-8 veces el valor del control a las 24 horas. Este máximo coincide con el peak de aumento en proteínas totales medidas con el método de Bradford, que también es de 7 veces el valor del control (Tabla 1).


Distintas formas inmuno-reactivas de la α1-AT en el LBA sometido a electroforesis en condiciones no desnaturantes.

A diferencia de lo descrito para los geles en condiciones desnaturantes, cuando la electroforesis se realiza en condiciones no desnaturantes, es decir sin modificar la estructura terciaria o los complejos que forma la α1-AT, se identifican bandas inmuno-reactivas de diferente movilidad electroforética10. En el blot representativo mostrado en la Figura 3 es posible observar en el control, dos bandas inmuno-reactivas a α1-AT; una más intensa, de peso molecular 52 kDa y otra de tamaño molecular mayor a 75 kDa, que probablemente corresponde a un complejo entre la α1-AT y la elastasa (30 kDa)10,13.



Después de la instilación de elastasa es posible distinguir dos efectos en las primeras 24 horas: a) un significativo aumento en la intensidad de las bandas presentes en el control y b) la aparición de dos nuevas zonas inmuno-reactivas:

•   Una banda de tamaño molecular inferior a 40 kDa.
•   Una banda de tamaño molecular superior a 100 kDa.

La Tabla 2 muestra el promedio de los resultados de 5 electroforesis en condiciones no desnaturantes. En ella se muestra que la participación de las distintas formas descritas en la inmuno-reactividad total para cada tiempo post-elastasa es variable y las principales diferencias con el control se observan en las primeras 24 horas.


Si bien en la Tabla 2 la proporción de α1-AT libre (banda 52 kDa) es de 25% a las 24 horas, valor inferior al 43,9% presente en el control, debe considerarse que de acuerdo a la Figura 2. el aumento en α1-AT total es de ocho veces. por lo que a pesar de encontrarse la α1-AT formando distintos complejos y posiblemente en parte degradada (< 40 kDa), la concentración de α1-AT libre (52 kDa) es varias veces superior a la del control.

Discusión

Los resultados de este estudio muestran que mediante técnicas electroforéticas y de inmuno-detección por western blot, es posible identificar distintas formas de α1-AT en los espacios aéreos del pulmón, las que varían dependiendo del tiempo de evolución del daño inducido por la instilación de elastasa.

Además de la banda de 52 kDa correspondiente a la α1-AT nativa14, encontramos evidencias de la participación de esta antiproteasa en la formación de complejos de distintos tamaños. El complejo con mayor probabilidad de formarse es el de la α1-AT con la elastasa instilada. La banda de peso molecular > 75 kDa correspondería a este complejo10-17. Otras proteínas con las que es capaz de reaccionar la α1-AT incluyen: a) proteínas propias del LBA como por ejemplo urokinasa20; y b) proteínas que aparecerían en éste, debido al aumento de permeabilidad alvéolo-capilar18-21. Por último, se ha descrito que la α1-AT puede formar complejos consigo misma (banda > 100 kDa3,10. De igual forma identificamos bandas inmuno-reactivas de menor tamaño, sugerentes de fenómenos de proteólisis que afectarían a la α1-AT23-24.

La instilación IT de elastasa en distintos animales de experimentación produce un daño alveolar difuso caracterizado por el aumento en la permeabilidad alvéolo-capilar con edema, hemorragia e infiltración de células inflamatorias, el que tiene su máxima intensidad a las 24 horas25. En estas condiciones se espera que la α1-AT experimente diversas modificaciones tendientes a contrarrestar el daño proteolítico disminuyendo su actividad. Entre ellas están: la formación de complejos con la elastasa instilada11, la oxidación de su sitio activo por oxidantes liberados desde las células inflamatorias reclutadas al pulmón26-30, y la inactivación proteolítica como fue descrita por Banda y cols23,24.

Sin embargo, en un estudio previo en nuestro laboratorio encontramos que el LBA de la rata después de la instilación IT de elastasa presenta un aumento en la actividad de α1-AT8, sugiriendo la existencia de algún mecanismo que contribuye a aumentar la concentración de α1-AT activa en los espacios aéreos.

El estudio actual muestra (Figura 4) que la concentración de α1-AT aumenta en el LBA unas 7-8 veces, gracias a la llegada masiva de proteínas séricas debido al aumento de la permeabilidad alvéolo-capilar (Figura 1), que es parte del daño alveolar difuso inducido por la elastasa instilada25.


El aumento de permeabilidad es un fenómeno conocido y es la base del daño alveolar difuso producido por distintos agentes. El curso temporal del aumento de permeabilidad en nuestro trabajo concuerda con los resultados publicados por Schmid y cols31 quienes encontraron que la permeabilidad alvéolo-capilar en el hámster, medida con marcadores radioactivos aumenta desde las primeras horas post elastasa, permanece aumentada a los tres días y se normaliza al quinto día

El curso temporal del aumento en la concentración de α1-AT coincide con el curso temporal del aumento en la actividad de la α1-AT mostrada por Salazar y cols, si bien las magnitudes respectivas no son las mismas.

De acuerdo a los resultados obtenidos de la electroforesis en condiciones no desnaturantes (Figura 3), a las 24 h post-elastasa, más del 74% de la α1-AT se encuentra formando complejos de distinto tamaño o como fragmento proteolítico. Sólo el 25% se encuentra como una banda de 52 kDa, parte de la cual es responsable del aumento del 60% en la actividad de α1-AT descrito por Salazar y cols8. Estos resultados sugieren que en el modelo de instilación IT de elastasa en la rata, los fenómenos de oxidación que inactivarían a la α1-AT y que han sido descritos principalmente en relación al daño por humo de cigarrillo14-18, son de menor relevancia que los fenómenos de formación de complejos.

En conclusión, la llegada masiva de α1-AT desde la circulación provee de defensa más que suficiente para limitar el daño inducido por la elastasa en la rata. Fenómenos como los descritos pueden participar en otros procesos inflamatorios pulmonares. Se desconoce si los fenómenos encontrados en la rata se presentan también en el hámster, una especie que se caracteriza por ser deficiente en α1-AT y por su mayor vulnerabilidad al daño pulmonar inducido por elastasa32. Es posible que diferencias inter-especies en la respuesta de la α1-AT en los espacios aéreos post-elastasa se relacionen con diferencias inter-especies en la magnitud del enfisema resultante32,33.

 

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Correspondencia a:

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Centro de Investigaciones Médicas.
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