Rev Chil Nutr Vol. 29, N°2, Agosto 2002

 

OXIDOS DEL COLESTEROL (OXISTEROLES):
FACTORES QUE CONDICIONAN SU FORMACION,
EFECTOS BIOLOGICOS, Y SU PRESENCIA EN LOS ALIMENTOS.

CHOLESTEROL OXIDES (OXISTEROLS):
FACTORS CONDITIONING THEIR FORMATION, BIOLOGICAL EFFECTS
AND CONTENT IN FOODS

Alfonso Valenzuela B, Julio Sanhueza C y Susana Nieto K.
Laboratorio de Lípidos y Antioxidantes
Instituto de Nutrición y Tecnología de los Alimentos (INTA), Universidad de Chile.

ABSTRACT

Cholesterol oxides are formed when raw materials or finished products containing cholesterol are subjected to a heat treatment or to other physical or chemical conditions that promote the oxidation of cholesterol. Chromatographic methods allow the identification of at least 35 different cholesterol oxides. The mechanism for cholesterol oxides formation it is not yet clear, although it is believed that the molecular events producing oxidation are similar, and probably simultaneous, to those producing the oxidation of unsaturated fatty acids in fats and oils. Many biological effects attributed to cholesterol oxides, such as cell membrane structure modification, alteration of functions involved in cholesterol biosynthesis, and other cell activities are being described in this review. Furthermore, it has recently been suggested that cholesterol oxides are potentially more atherogenic than cholesterol by itself. Since the relatively high presence of cholesterol oxides in foods is a major concern for processors, new procedures designed to prevent their formation are currently under development. The role played by conventional synthetic antioxidants, as well as those found in nature, in the prevention of cholesterol oxides formation in foods is an active research area.
Key words: Cholesterol, cholesterol oxides, atherogenesis, synthetic antioxidants, natural antioxidants.

Este trabajo fue recibido el 18 de Marzo de 2002 y aceptado para ser publicado el 11 de Julio de 2002.

INTRODUCCION

El colesterol (5-colestene-3,b -ol) es un esteroide de origen animal que cumple numerosas funciones metabólicas: constituye la estructura básica para la formación de las hormonas esteroidales, a partir de él se forman las sales biliares que cumplen un rol importante en la digestión y absorción de las grasas en el tracto digestivo, posee importantes funciones regulatorias en el metabolismo intracelular de los ácidos grasos, y es, junto con los fosfolípidos, uno de los componentes más importantes de las membranas celulares (citoplasmática, nuclear y de organelos) (1-3). De hecho, se estima que cada dos o tres moléculas de fosfolípido que forman la matriz lipídica de las membranas, existe una molécula de colesterol. Es por estas razones que los organismos animales poseen la capacidad de biosintetizar colesterol prácticamente en todas sus células, siendo también la razón de por qué nuestra dieta debe contener una cierta cantidad de colesterol, el cual es importante en los recién nacidos y en los niños en edad de crecimiento, ya que ellos requieren formar nuevas células y tejidos (4). Es importante destacar que la alimentación experimental con dietas totalmente carentes de colesterol en ratas, produce en las crías efectos teratogénicos, como el nacimiento de animales cíclopes o sin abertura buco-nasal (5).

LA VIA DIGESTIVA Y METABOLICA
DEL COLESTEROL

Los procesos de digestión, absorción y transporte del colesterol son bien conocidos. Básicamente el colesterol, o sus ésteres previamente hidrolizados, que constituyen la principal forma en que el colesterol está presente en nuestra dieta, son absorbidos por las células intestinales en conjunto con los ácidos grasos y los monoacilglicéridos formados por la acción de las lipasas intestinales (6). En estas células el colesterol es nuevamente reesterificado y transportado, primero a través de la linfa (vasos linfáticos) y posteriormente en la sangre, hacia el resto de las células del organismo, formando parte así de los quilomicrones (QM) (7). La utilización de los QM por las células periféricas (no hepáticas) les permite obtener colesterol para sus necesidades metabólicas. Del mismo modo, el hígado forma constantemente colesterol y lo exporta hacia las células periféricas como parte de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), y que también, al igual que los QM, cumplen la función de proveer de ácidos grasos y de colesterol a las células periféricas. De esta manera, después de una ingesta de alimentos que contienen grasas y colesterol, los QM constituyen la fuente primaria de lípidos para el organismo. Sin embargo en los períodos de ayuno fisiológico, el aporte de lípidos, incluido el colesterol, es realizado por el hígado mediante la secreción de las VLDL. Estas lipoproteínas son transformadas en el sistema vascular que irriga a las células periféricas, en lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) y posteriormente en lipoproteínas de baja densidad (LDL) (8). En la transformación VLDL ® LDL interviene la lipoproteína de alta densidad, identificada como HDL. Esta lipoproteína actúa como una especie de "basurera" celular ya que es capaz de captar; el colesterol que es liberado por las células que mueren (muerte celular natural o apoptosis); el colesterol que proviene de restos de membranas celulares que son liberadas por las células al torrente sanguíneo como producto del recambio de éstas; y el colesterol que se acumula en las paredes vasculares y que potencialmente va a formar parte de una placa ateromatosa (9). El colesterol libre, producto de los procesos metabólicos mencionados, es esterificado por la enzima lecitina-colesterol acil transferasa (LCAT) y posteriormente transferido a la IDL por la proteína de transferencia de colesterol (PTC), para transformarla en una LDL (10). Las LDL también son utilizadas por las células periféricas y por el hígado, tejidos que las internalizan y degradan, utilizando con fines metabólicos todos sus componentes (aminoácidos, ácidos grasos y el colesterol). Diferentes circunstancias tales como la edad, algunas condiciones genéticas y/o patológicas, o los hábitos alimenticios, producen un aumento paulatino del nivel de LDL sanguíneo, facilitando, entre otros factores, el desarrollo de la artereosclerosis, que a su vez forma parte importante de las enfermedades cardiovasculares, primera causa de muerte en los países de occidente. Desde este punto de vista es universalmente aceptado que concentraciones altas de LDL a nivel sanguíneo, constituyen entre otros factores, un antecedente importante de riesgo cardiovascular.

EL COLESTEROL, UNA MOLECULA
SUSCEPTIBLE A LA OXIDACION

La oxidación de los lípidos (grasas y aceites), es también conocida como rancidez oxidativa para diferenciarla de la lipoperoxidación celular, aunque conceptualmente ambos procesos significan lo mismo: la destrucción por oxidación de los ácidos grasos mono y poliinsaturados presentes en los alimentos (en el caso de la rancidez oxidativa) o en las membranas biológicas u otros componentes celulares (en el caso de la lipoperoxidación). La rancidez oxidativa es un proceso químico que ha sido activamente estudiado y su(s) mecanismo(s) de acción y los productos que genera son relativamente bien conocidos (11). Sin embargo, la participación del colesterol en este proceso ha sido escasamente abordada. El colesterol por su estructura química, es un derivado del ciclopentano perhidrofenantreno, posee un doble enlace entre los carbonos 5 y 6 del anillo aromático, que es también susceptible de sufrir oxidación. De esta manera, cuando el colesterol, presente en muestras biológicas o en materias primas, u otros productos oleosos que lo contienen, es sometido a una oxidación, da origen a una serie de productos oxidados, de diferente estructura, aún no del todo definidos químicamente, que se identifican colectivamente con el nombre de oxisteroles (12). En la actualidad se discute el o los efectos derivados del consumo de oxisteroles en nuestra alimentación, y también el rol que estos productos de oxidación pueden tener en el control de la función celular.

Los oxisteroles se forman toda vez que el colesterol como tal, o un producto orgánico que lo contiene (grasa o aceite), es sometido al efecto directo o indirecto de la temperatura, irradiaciones, metales (bivalentes, principalmente) o a agentes oxidantes orgánicos, como es el caso de algunas enzimas. El mecanismo de la oxidación no está del todo establecido (12), aunque se ha propuesto que los radicales libres formados en los grupos metilénicos de la cadena hidrocarbonada del ácido graso (o en los peroxiradicales derivados de la oxidación) y que inician la rancidez oxidativa, también serían iniciadores de la oxidación del colesterol (13). El carácter anfipático del colesterol, que le permite interactuar con los fosfolípidos o los diacilglicéridos en interfases óleo-acuosas, facilitaría su oxidación (14), ya que este proceso ocurre en forma más efectiva y rápida en las interfases óleo-acuosas (15). Se ha observado que las formas activas del oxígeno (radical libre hidroxilo, oxígeno singlete) que son iniciadoras de la oxidación de ácidos grasos poliinsaturado (15), así como también los productos oxidados que se forman en los ácidos grasos poliinsaturados (peróxidos, hidroperóxidos, epóxidos, entre otros), pueden también iniciar y/o propagar la oxidación del colesterol (16), la que ocurriría en forma paralela a la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados (17). La evidencia experimental indica que la oxidación del colesterol se induciría en la fase primaria de la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados (iniciación) (18). Se estima que es posible la formación de 34 productos distintos de oxidación del colesterol (19), sin embargo no todos se han identificado, siendo los oxisteroles menos polares los mejor caracterizados (18). Los productos más comunes de oxidación no enzimática del colesterol, claramente identificados y que se ofrecen comercialmente como estándares o para fines experimentales, se muestran en la figura 1.

EFECTOS BIOLOGICOS DE
LOS OXISTEROLES

La evidencia experimental ha permitido acumular información sobre los efectos biológicos de los oxisteroles. Si bien esta información ha sido obtenida a partir de modelos desarrollados in vitro, los resultados de muchos de ellos pueden ser extrapolados a situaciones in vivo. A manera de ejemplo, en diferentes modelos de estudio (células en cultivo, homogeneizados celulares, sistemas reconstituidos, entre otros), se ha observado que la adición de oxisteroles al sistema produce numerosos efectos, algunos de los cuales se describen a continuación. Se ha demostrado que diferentes oxisteroles se comportan como inhibidores de la síntesis celular del colesterol, este efecto lo ejercen inhibiendo a la enzima hidroximetilglutaril CoA reductasa (HMG Co A red) (20), punto clave en la regulación de la síntesis del colesterol (21). Esta inhibición impide a la célula sintetizar su propio colesterol, produciéndose alteraciones a nivel de las membranas plasmática e intracelular, afectando su fluidez y funciones y produciendo finalmente la muerte celular (22). Recientemente se ha demostrado que los oxisteroles también pueden regular la síntesis de la HMG CoA actuando sobre un receptor nuclear de esteroides identificado como LXR (23). Se ha demostrado, además, que los oxisteroles inducen la apoptosis (muerte celular programada) en cultivos de tejidos (24). También inhiben la síntesis del DNA, lo cual detiene el ciclo celular interfiriendo la división y proliferación de células en cultivo (25). Además, alteran la homeostásis del calcio (26). La concentración de este ión, fundamentalmente en muchas funciones celulares como segundo mensajero, debe ser finamente controlada a través de sistemas enzimáticos que extraen calcio de la célula (bombas de calcio, Ca-ATPasas), ya que la gradiente química de concentración favorece la entrada de calcio a la célula en una relación de concentración extracelular-intracelular de mil a diez mil veces. Los oxisteroles inhiben la actividad de la bomba de calcio (27). Otro efecto biológico de los oxisteroles es la inducción de la agregación de la trombina, lo cual podría explicar el efecto trombótico observado para estos productos de oxidación (28). Además, en estudios in vitro se ha observado efectos mutagénicos (29) y procarcinogénicos para algunos oxisteroles (30). Cabe destacar que la absorción y reabsorción intestinal de los oxisteroles en humanos es similar a la del colesterol (31). La administración de oxisteroles a palomas en una proporción equivalente a la ingesta promedio de oxisteroles estimada para los norteamericanos, produce un aumento en la formación de ateromas, comparado con las aves controles que sólo reciben colesterol (32). Las palomas son uno de los modelos más utilizados para estudiar la aterogénesis producida por componentes dietarios.

De todos los efectos atribuidos a los oxisteroles, quizás el que resulta más impactante o probablemente de mayor importancia, es el rol que éstos pueden tener en la aterogénesis (12), especialmente a través de la inducción de la oxidación de las LDL (33). A través del tiempo se ha acumulado información respecto a que la oxidación de la estructura lipídica de las LDL, constituiría un factor aterogénico aún más importante que los niveles altos de esta lipoproteína, o de una relación colesterol-LDL/ colesterol-HDL no adecuada (34). Las LDL serían susceptibles de oxidarse cuando a nivel del plasma sanguíneo se produce una deficiencia de antioxidantes, tanto endógenos como exógenos (estos últimos provistos por la dieta) (35). Estas LDL oxidadas se acumulan en el endotelio de los vasos sanguíneos constituyendo uno de los componentes más importantes del ateroma (36). En este proceso de oxidación, donde participan activamente como substratos los ácidos grasos poliinsaturados presentes en los triacilglicéridos que forman parte del núcleo central de la LDL, también intervendría el colesterol, presente tanto en la parte central como en la periferia de la LDL. El cuadro 1 reproduce el resultado de Addis y Warner (33), en la cual se puede observar que la oxidación de LDL in vitro va acompañada por la formación de una variedad de oxisteroles. Se desconoce el efecto que puede tener la presencia de estos productos de oxidación en la función metabólica y en la probable acción patológica de esta lipoproteína. La figura 2 resume las principales características químicas de los oxisteroles y la figura 3 resume los principales efectos biológicos de los oxisteroles.

IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION DE
OXISTEROLES EN DIFERENTES PRODUCTOS

El avance logrado actualmente en la identificación y cuantificación de los oxisteroles formados durante el procesamiento de materias primas, productos de manufactura intermedia o productos terminados, ha sido posible debido al desarrollo y al uso simultáneo de técnicas de cromatografía en capa fina de alta resolución, cromatografía líquida de alta presión y cromatografía gaseosa en columna capilar con confirmación mediante espectrometría de masa. Estas técnicas han permitido la identificación de al menos 35 oxisteroles diferentes. En términos generales, el procedimiento para la aislación e identificación de oxisteroles en muestras biológicas y de alimentos es el siguiente:

1.- Extracción de la fracción lipídica, que se realiza mediante métodos convencionales en frío.

2.- Saponificación en frío, que se realiza a temperatura ambiente para evitar el efecto de la temperatura en la formación de una mayor cantidad de oxisteroles en la muestra (37).

3- Separación y cuantificación mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) (38) o cromatografía gas-líquido utilizando columna capilar (37).

4.- Confirmación de estructura mediante espectrometría de masas de los oxisteroles en la forma de trimetilsililester derivados por comparación con una biblioteca de datos para este tipo de estructuras (37). La figura 4 resume el procedimiento general para la aislación y cuantificación de oxisteroles.

PREVENCION DE LA FORMACION DE
OXISTEROLES: EL ROL DE LOS
ANTIOXIDANTES

Los antioxidantes, tanto aquellos de origen sintético como natural, son ampliamente utilizados por la industria oleoquímica para prevenir o para retrasar el desarrollo del proceso oxidativo de las grasas y aceites. El mecanismo de acción de estos productos ha sido intensamente estudiado, estableciéndose cuales de ellos son los más adecuados para ser aplicados a diferentes tipos de grasas o aceites. Es así como antioxidantes tales como el butil hidroxitolueno (BHT), el butil hidroxianisol (BHA), la terbutil hidroxiquinona (TBHQ), los galatos de propilo u octilo, o los tocoferoles (vitamina E), entre otros, son extensamente aplicados en la estabilización de grasas o aceites tanto de origen animal como vegetal, con resultados que dependen de la cantidad y tipo de antioxidante(s) utilizados(s) (39). Sin embargo, la información respecto al efecto de estos antioxidantes en la prevención de la formación de oxisteroles es muy escasa. Uno de los pocos estudios disponibles sobre el efecto de antioxidantes en la formación de oxisteroles fue realizado por Huber et al (40), utilizando yema de huevos secada mediante un secador spray. Los resultados de este estudio son de difícil interpretación debido principalmente, y como lo comentan los propios autores, a la complejidad del modelo utilizado. Li et al (41), estudiaron el efecto del a -tocoferol en la inhibición de la formación de oxisteroles por efecto de la temperatura y de la adición de colesterol en aceite de pescado, aceite de girasol y aceite de palma. Observan que el a -tocoferol sólo inhibe la formación de oxisteroles en el aceite de pescado, siendo no efectivo como antioxidante en los aceites vegetales. Los autores no ofrecen explicación a esta diferencia en la acción del antioxidante, aunque postulan un mecanismo diferente para la formación de oxisteroles en aceites animales (de pescado en este caso) y aceites vegetales. Más recientemente Shozen et al (42), realizaron un estudio de protección de polvo de anchoa (anchoveta deshidratada y molida), producto de gran consumo en los países asiáticos, por efecto del BHA y del a -tocoferol. Estudiaron la variación del contenido de ácidos grasos poliinsaturados y la formación de oxisteroles en el producto envasado en función del tiempo. Observaron una correlación entre la disminución del contenido de ácidos grasos poliinsaturados y el aumento en la formación de los oxisteroles, con lo cual argumentan la existencia de un mecanismo común de oxidación. Sin embargo, sólo el a -tocoferol inhibe la formación de oxisteroles, siendo casi inefectivo el BHA (salvo en el producto envasado al vacío). Recientemente, nuestro grupo demostró que el BHT y el TBHQ son antioxidantes que pueden inhibir la oxidación del colesterol cuando esta es inducida en conjunto con la oxidación de un aceite vegetal poliinsaturado (43). El mismo efecto se observó para el caso del a - y el g -tocoferol (44), con el antioxidante natural grado alimenticio extracto de rosemary, y con el flavonoide quercetina (45)

PRESENCIA DE OXISTEROLES EN
PRODUCTOS DE CONSUMO HABITUAL

Los alimentos que contienen colesterol en forma natural, carnes, huevos y derivados lácteos, a pesar de presentar cantidades relativamente importantes del esteroide (carnes en promedio 25-80 mg/100g, huevo: 200-220 mg/ unidad, leche fluída: 12-15 mg/100g, mantequilla: 180-200 mg/100g), en forma no procesada y/o recientemente obtenidos, prácticamente están libres de oxisteroles, o sólo presentan trazas de éstos (14). Sin embargo, cuando son procesados, esto es, sometidos a calentamiento, fritura, secado spray, desecación, tratamientos UHT, irradiación, etc, pueden presentar cantidades de oxisteroles en rangos que van de 80 a 1200 ppm, dependiendo del producto, del proceso a que fue sometido, del tipo y tiempo de embalaje, etc. (46). Estos productos corresponden a oxisteroles formados no enzimáticamente, ya que también intracelularmente hay enzimas que realizan la oxidación del colesterol y cuyos productos tienen importantes funciones regulatorias en la actividad celular (3), pero cuyo aporte cuantitativo es irrelevante desde el punto de vista tecnológico si se le compara con la formación de oxisteroles por manipulación química y/o física de una grasa de origen animal o de un producto que contiene colesterol. El cuadro 2 muestra diferentes niveles de oxisteroles informados por distintos autores en algunos alimentos de consumo habitual. La variabilidad de los resultados es consecuencia de la aplicación de diferentes procedimientos de obtención, separación y/o análisis, del origen de las muestras y de los procedimientos aplicados a éstas con anterioridad. Sin embargo, llama la atención que hay productos que de acuerdo a estos criterios constituyen un importante aporte de oxisteroles, tal es el caso de los aceites animales post-fritura, el huevo entero en polvo y la yema de huevo en polvo, estas últimas muy utilizadas en la fabricación de mayonesas, aderezos, y en repostería (14).

PRESENTE Y FUTURO DE LOS OXISTEROLES

Sin lugar a dudas, la química, la bioquímica y el impacto biológico y tecnológico de los oxisteroles, constituyen áreas de investigación donde queda aún mucho por realizar. Sin embargo, a la luz de lo comentado en este trabajo, es posible concluir que los oxisteroles deben ser considerados seriamente como productos indeseables en nuestra alimentación, tal como se considera en la actualidad a los ácidos grasos saturados, a los productos de oxidación de los ácidos grasos, y a los isómeros geométricos y posicionales trans (47). Dicho de otro modo, los oxisteroles deben constituir un motivo de preocupación de parte de aquellos que manufacturan y/o transforman alimentos, y de aquellos encargados de la regulación y del control de lo que consume la población en general. Es probable que en el futuro el contenido de oxisteroles de un producto deba ser declarado, tal como ocurre ahora con los ácidos grasos saturados, y en un futuro muy próximo con los isómeros geométricos y posicionales trans de los ácidos grasos. El presente milenio nos espera con más sofisticaciones y exigencias tanto en el diseño y manufactura, como en la presentación, etiquetaje y regulación que se ejercerá sobre el expendio de muchos productos alimenticios.

RESUMEN

Los oxisteroles, productos de oxidación del colesterol, se forman cuando las materias primas o los productos terminados que contienen colesterol son sometidos a tratamientos térmicos, a agentes oxidantes, o a otras condiciones físicas y/o químicas que facilitan la oxidación del colesterol. Los procedimientos analíticos, principalmente basados en técnicas cromatográficas, han permitido identificar al menos 35 oxisteroles diferentes. El mecanismo de formación de los oxisteroles aún no está del todo claro, aunque se propone que los eventos moleculares que producen la oxidación del colesterol son similares, y probablemente simultáneos a los que ocasionan la oxidación de los ácidos grasos insaturados de las grasas y aceites. Se han descrito numerosos efectos biológicos atribuibles a los oxisteroles, como la alteración de la estructura y función de las membranas celulares, y el cambio en la actividad y en la expresión de enzimas involucradas en la biosíntesis del colesterol. En otras actividades celulares, los oxisteroles afectan la coagulación de la sangre, y se ha propuesto que serían potencialmente más aterogénicos que el propio colesterol. La presencia de cantidades relativamente altas de oxisteroles en alimentos de consumo habitual es motivo de preocupación, por lo cual se busca desarrollar procedimientos que impidan su formación. El rol de los antioxidantes sintéticos convencionales, así como de aquellos de origen natural de nuevo desarrollo, en la prevención de la formación de oxisteroles, principalmente en alimentos, es motivo de activa investigación.

Palabras claves: Colesterol, óxidos del colesterol, aterogénesis, antioxidantes sintéticos, antioxidantes naturales.

Agradecimientos: Los autores agradecen a FONDECYT (proyecto 1990759), a Alltech Biotechnology (USA), y a FONDEF (proyecto 1125) el financiamiento de su investigación.

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47.- Valenzuela, A., King, J., Nieto, S. Trans fatty acid isomers from hydrogenated fats: The controversy about health implications. Grasas y Aceites 1995; 46: 369-375.

48.- Valenzuela, A., Alonso, P., Millacoy, A., Sanhueza, J., Nieto, S. Content of cholesterol oxidation products in some Chilean commonly processed foods. Int. J. Food Sci Technol 2002 (enviado a publicar)

Dirigir la correspondencia a:

Profesor Alfonso Valenzuela B.

Laboratorio de Lípidos y Antioxidantes

INTA – Universidad de Chile

Macul 5540 – Macul

Fono: 678 1448

Fax: 221 4030

E-mail: avalenzu@uec.inta.uchile.cl