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Parasitología latinoamericana

versión On-line ISSN 0717-7712

Parasitol. latinoam. v.60 n.3-4 Santiago dic. 2005

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-77122005000200001 

 

Parasitol Latinoam 60: 105 - 121, 2005 FLAP

ARTÍCULO ORIGINAL

Inactivación de la Dihidrolipoamida Deshidrogenasa de Trypanosoma cruzi por Fenotiazinas en presencia de Citocromo c y Peróxido de Hidrógeno. Efectos de losAntioxidantes

Trypanosoma cruzi DIHYDROLIPOAMIDE DEHYDROGENASE IS INACTIVATED BY PHENOTHIAZINES IN THE PRESENCE OF CYTOCHROME C AND HYDROGEN PEROXIDE. EFFECTS OF ANTIOXIDANTS

 

JOSÉ GUTIÉRREZ-CORREA*, y ANDRÉS O.M. STOPPANI**

* Instituto de Medicina Tropical Daniel A. Carrión. Facultad de Medicina. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú.
** Centro de Investigaciones Bioenergéticas. Facultad de Medicina (UBA-CONICET) Buenos Aires, Argentina.

Correspondencia a :


Cytochrome c catalyzed the oxidation of phenothiazines (PTZ) in the presence of hydrogen peroxide. The transient formation of the promazine radical cation (PZ+.) has been demonstrated by light absorption measurements as well as by its conversión to promazine sulfoxide. Trypanosoma cruzi dihydrolipoamide dehydrogenase (LADH T c) was irreversibly inhibited by treatment with cytochrome c (cyt c)/H2O2 system supplemented with PTZ. LADH T c inactivation depended on a) The PTZ structure b) Time of incubación with the complete oxidant system c) The presence of an antioxidant that intercept free radicals. PZ, thioridazine (TRDZ) and trimeprazine (TMPZ), were the most effective systems out of twelve PTZ studied, with inactivation values of 82, 76 and 72%, respectively, after 90 min of incubation. LADH T c inactivation by PZ (with alkylamine substituent at N 10 position) decreased by its structural modification at 2 position (inactivation PZ > chlorpromazine (CPZ) > propionylpromazine (PPZ)>trifluopromazine (TFPZ)) or at N 10 position (inactivation PZ > TMPZ > promethazine (PMTZ)) PTZ activity with piperidinyl substituent at N10 position depended on the group at 2 position (TRDZ, with thiomethyl group, has high inactivating effect on LADH T c; propericyazine (PCYZ), with cyano group, is much less active). Apparently, piperazinyl substituent at the N10 position on the phenothiazine have not an important function in the compound's inactivating effect on LADH T c. The effect of PTZ with Cl at 2 position (CPZ, prochlorperazine (PCP), perphenazine (PFZ)) was higher than the effect of compounds with CF3 in the same position (TFPZ,trifluoperazine (TFP),fluphenazine (FFZ) ) independent on the structure of substituents at N10 position. Production of PTZ+. radicals was essential for LADH T c inactivation and this effect depended on the stability of these free radicals. Comparision of inactivation values for LADH T c and mammalian LADH demonstrated a greater sensitivity of LADH T c to various PTZ studied. Thiol compounds (such as GSH and N-acetylcysteine), tyrosine, tryptophan, NADH, ascorbate and trolox prevented LADH T c inactivation by the cyt c/H2O2/PTZ systems in agreement with their ability for to suppress PTZ+. radicals. The role of PTZ+. as enzyme inhibitors, or as generators of secondary free radicals and metabolite depletors for phenothiazines cytotoxicity is discussed.

Key words: Phenothiazines, Trypanosoma cruzi, Dihydrolipoamide Dehydrogenase, Cytochrome c.


RESUMEN

El citocromo c catalizó la oxidación de las fenotiazinas (FTZ) en presencia de peróxido de hidrógeno. La formación del radical catiónico de promazina (PZ+.) se demostró por espectrofo-tometría y por su conversión a promazina sulfóxido La dihidrolipoamida deshidrogenasa (LADH) del Trypanosoma cruzi es inhibida irreversiblemente por el sistema citocromo c/H2O2 complementado con fenotiazinas. La inactivación de la LADH del parásito varía según la estructura de las FTZ, el tiempo de incubación del sistema pro-oxidante con la LADH, y la presencia de un antioxidante supresor de radicales FTZ+. Entre las 12 FTZ ensayadas, la promazina (PZ), tioridazina (TRDZ) y trimeprazina (TMPZ) fueron las más efectivas produciendo inactivaciones de 82%,76% y 72%, respecti-vamente, a los 90 min de incubación. El efecto de PZ (con grupo alquilamino en la posición N 10) disminuyó por modificación de su estructura en la posición 2 (efecto inactivante de PZ > cloropromazina (CPZ) > propionilpromazina (PPZ) > trifluopromazina (TFPZ) o en la posición 10 ( efecto inactivante de PZ > TMPZ > prometazina (PMTZ).El efecto de las FTZ con sustituyente piperidinil en N 10 dependió del grupo de la posición 2 ( SCH3, en TRDZ de mayor efecto; CN, en propericiazina (PCYZ), la de menor efecto entre las FTZ estudiadas). Parece que la presencia del sustituyente piperazinil en posición N 10 no tiene función importante en el efecto inactivante de las FTZ, el cual dependió de la estructura del grupo en la posición 2. El efecto de los compuestos con Cl en posición 2 (CPZ, procloroperazina (PCP), perfenazina (PFZ)) fue mayor que el obtenido con los compuestos CF3 (TFPZ, trifluoroperazina (TFP), flufenazina (FFZ), e independiente de la estructura del sustituyente N 10.El efecto de las FTZ sobre la LADH de T. cruzi depende, por lo menos en parte, de la estabilidad de los radicales FTZ+. generados por la actividad peroxidasa. La LADH T c, en comparación con la LADH de mamífero, presentó mayor sensibilidad al efecto inactivante de los radicales catiónicos de varias FTZ estudiadas.Los compuestos tiol (GSH, Cys, NAC, PAM, CPT), Tyr, Trp, NADH, ascorbato y trolox, protegieron a la LADH frente a los radicales PZ+., suprimiendo su reactividad. Se plantea la posible participación del citocromo c en el mecanismo de la acción tripanocida de las FTZ, mediante la generación de radicales FTZ+. y consiguiente inactivación de la LADH o la acción de los radicales libres secundarios y el consumo de metabolitos como resultado de la actividad de los antioxidantes.


 

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria crónica, endémica en extensas áreas de América-entre el norte de Méjico y el sur de Argentina-que tiene como agente etiológico al Trypanosoma cruzi (T c). Recientemente se ha estimado que 18-20 millones de personas están infectadas y que anualmente se producen aproximadamente 200.000 nuevos casos1,2. El tratamiento actual de esta enfermedad no es totalmente efectivo y suele producir severos efectos adversos. Estas limitaciones justifican la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos, o la reevaluación de fármacos de efectos tripanocidas, orientados a una quimioterapia selectiva de esta enfermedad1,3. Las fenotiazinas (FTZ) tienen múltiples actividades biológicas, destacando los efectos antipsicóticos, antibacterianos, antipara-sitarios, antiretrovirales y antimultidrogas resistencia4,5. Entre los efectos antiparasitarios de FTZ se encuentran los relacionados al T c, como el aumento del AMP cíclico6, la inhibición de la cAMP fosfodiesterasa7, los cambios morfológicos de la membrana celular8, la desorganización mitocondrial9, 10, la modificación de la evolución de la enfermedad de Chagas experimental11, la inactivación de la tripanotiona reductasa (TR)12,13 y de la dihidrolipoamida deshidrogenasa (LADH)14. En trabajos previos demostramos que la mieloperoxidasa (MPO) y la mioglobina (Mb) modificada por el peróxido de hidrógeno, catalizaron la producción de radicales libres catiónicos de FTZ (FTZ+.), los cuales inhibieron irreversiblemente la TR y LADH del T c13,14. Estos resultados sugieren que los radicales FTZ+. pueden contribuir a la acción tripanocida de FTZ. En el presente estudio hemos extendido nuestras observaciones al efecto del citocromo c(cit c), en presencia de H2O2 y FTZ, sobre la actividad LADH de T c. Esta enzima, componente esencial de los complejos multienzimáticos piruvato, a ceto glutarato y a ceto ácidos de cadena ramificada deshidrogenasas, posee dos centros catalíticos: el FAD y el disulfuro redox, y cataliza la reducción reversible de la lipoamida, L( S )2 por el NADH, (Reacción1), a dihidrolipoamida, L(SH)2 15.

NADH + H+ + L(S)2 « NAD+ + L(SH)2 (1)

Estos complejos multienzimáticos tienen un rol principal en el metabolismo oxidativo del T c16. La LADH se encuentra en todos los estadíos de desarrollo del T. cruzi17, en concordancia con la actividad del ciclo del ácido cítrico durante todo el ciclo evolutivo del parásito.

El cit c es una pequeña hemoproteína intermembranas que, formando parte de la cadena respiratoria mitocondrial, transporta electrones entre los complejos III (ubiquinol-cit c reductasa) y IV (citocromo oxidasa). El grupo prostético hemo del cit c está unido covalentemente a la cadena polipeptídica, muy básica, por dos enlaces tioéter que involucran a la Cys14 y Cys17. El solvente es muy poco accesible al grupo hemo, el cual se encuentra cerca del extremo N-terminal en un ambiente hidrofóbico, formando con la His18 y la Met80 el 5° y 6° ligandos, respectivamente, del Fe18-20. El cit c además de su función en el metabolismo energético participa, al ser liberado desde las mitocondrias al citosol, en el control de la apoptosis, causando interrupción del flujo de electrones en la cadena respiratoria, aumento de la generación de superóxido, la formación del apoptosoma, la activación de las caspasas y la muerte celular21,22. El cit c reacciona con hidroperóxidos23-26 y puede inducir la peroxidación de los lípidos y la modificación de proteínas27. Asi mismo, el cit c puede catalizar en presencia de peróxido de hidrógeno, la oxidación de diversas moléculas como el 2-ceto-4-tiometil butírico28, linoleato29, 2-2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6 ácido sulfónico (ABTS), 4-amino antipirina y luminol30, N-metilcarbazol y tioanisol31, diclorofluo-rescina32,33, benceno34, y otras incluyendo catecolaminas35. El cit c se encuentra en altas concentraciones en el espacio íntermembranas mitocondriales, entre 0,5-5,0 mM36 y aunque normalmente la concentración de H2O2 es pequeña(10-10-10-9 M)37, cantidades excesivas se generan en condiciones fisiopatológicas que se acompañan de estrés oxidativo como en la inflamación y en la reoxigenación postisquemia38. Si las peroxidasas, y otras hemoproteínas como la hemoglobina39,40 y la mioglobina13,14 peroxidan a FTZ, el sistema cit c/H2O2 complementado con FTZ, sería un potencial generador de radicales libres catiónicos, los cuales pueden actuar sobre diversos blancos, como la TR y la LADH de T c, produciendo modificaciones que podrían determinar la acción tripanocida y otros efectos farmacológicos de las FTZ. El cit c es fácilmente liberado de las mitocondrias lesionadas y tendría acciones peroxidativas no sólo a nivel mitocondrial sino también en sitios extramitocondriales14. Los objetivos de este estudio son demostrar que el cit c, en presencia de peróxido de hidrógeno, oxida a las FTZ y determinar si los sistemas cit c/H2O2/FTZ actúan como inhibidores de la LADH de T c. En este sentido, el estudio se orienta a los siguientes aspectos: a) Efecto de estos sistemas oxidativos sobre la actividad LADH de T c y la relación estructura -actividad de las FTZ. b) Acción de los antioxidantes-interceptores de radicales libres- como blancos competitivos y protectores de la LADH. Además, como las diferencias estructurales entre la enzima del parásito y la LADH de mamífero17 han fundamentado la propuesta del diseño de inhibidores específicos de la enzima del T c, en este trabajo comparamos la inactivación de ambas enzimas por los sistemas cit c/H2O2/FTZ.

MATERIAL Y MÉTODOS

Enzimas y Reactivos: LADH de T c fue obtenida por expresión en E. coli JRG 1342 (17). La enzima se mantuvo a - 20°C en fosfatos (K) 100 mM, KCl 100 mM, EDTA 1.0 mM, pH 7.0, conteniendo glicerol al 50% (v/v). La actividad específica fue de ~ 400 U/mg de proteína. Esta preparación, que permaneció estable durante por lo menos un año, se diluyó al 25% (v/v) en fosfatos (K) 50 mM, pH 7,4 y se conservó a 4°C para los experimentos. LADH de miocardio porcino y citocromo c de miocardio bovino; las fenotiazinas (FTZ), guayacol, GSH, Cys, Met, NAC, PAM, CPT, Tyr, TyrGly, (TyrCys)2 , Trp, NADH, y ácido ascórbico se obtuvieron de Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA. PZ-SO, CPZ-SO y PMTZ-SO se prepararon por oxidación de la respectiva FTZ41 y fueron caracterizadas por cromatografía en capa delgada, por espectrofo-tometría midiendo la absorbancia a 341 nm (PZ y CPZ sulfóxidos, e = 6,3 y 5,9 mM-1 cm-1, respectivamente) ó 335 nm (PMTZ, e = 5,0 mM-1 cm-1), y por fluorometría (espectros de emisión, con excitación de 325 nm). Otros reactivos fueron iguales a los utilizados previamente14.

Actividad peroxidasa del citocromo c: Se determinó con guayacol (2-metoxifenol) como donante de hidrógeno42. En general, esta actividad fue medida a 30° C, con guayacol 13 mM, cit c 5 mM, fosfatos (K) 50 M, pH 7.4, y H2O2 0,5 mM. La reacción se inició con la adición del peróxido. El tetraguayacol, producto de la reacción, se midió por espectrofotometría a 470 nm hasta 60 min de incubación (e = 26,6 mM-1 cm-1). Se requieren 4 mmoles de H2O2 para generar 1 mmol de tetraguayacol. La actividad peroxidasa del cit c se calculó con los valores de absorbancia de la parte lineal de la respectiva curva de formación del tetraguayacol. El efecto de la concentración de H2O2 y de cit c sobre la actividad peroxidasa se estudió variando las concentraciones respectivas, según lo indicado en resultados. Luego, la actividad peroxidasa del cit c se exploró con PZ y PMTZ como sustratos, midiendo la producción de PZ-SO y PMTZ-SO. Esta determinación se fundamenta en que la oxidación de las FTZ por sistemas peroxidasa /H2O2 genera el radical catiónico FTZ+.14,40,43,44 el cual por una reacción no enzimática de dismutación (Reacción 2) produce el sulfóxido correspondiente con regeneración de la FTZ original39,40,45.

2FTZ+. + H2O ® FTZ-SO + FTZ + 2H+ (2)

Las condiciones experimentales para medir la actividad peroxidasa y el efecto de la concentración de cit c ( con PZ) o del GSH (con PMTZ), se indican en resultados (Figuras 4 y 5, leyendas).

Inactivación de la LADH: La mezcla de inactivación contenía LADH, cit c, H2O2, FTZ, fosfatos (K) 50 mM, pH 7,4 y otras adiciones como se indica en resultados. Además, esta mezcla contenía KCl 1,25 mM, EDTA 12,5 mM y glicerol 82 mM, resultado de la dilución de la preparación original de la LADH de T c. Muestras control, sin cit c o sin otros componentes de la mezcla de inactivación se estudiaron simultá-neamente. La incubación de las muestras (volumen final 0,1 ml) fue a 30°C durante los tiempos indicados en cada experimento. Para medir la actividad LADH, se transfirieron alícuotas de 10 ml a la mezcla de ensayo.

Actividad LADH: La actividad enzimática se midió a 30°C. por la velocidad de oxidación del NADH, usando lipoamida como aceptor de electrones. La mezcla de ensayo contenía fosfatos(K) 50 mM, pH 7.4, 10 ml de la mezcla de inactivación, lipoamida 1 mM y NADH 0,2 mM; volumen total 3,0 ml.

Determinación del radical PZ+. y de FTZ-SO: La concentración del radical PZ+. se determinó espectrofotométricamente utilizando el e518 = 7,71 mM-1cm-1. La mezcla de reacción contenía fosfatos (K) 50 mM, pH 6.5, cit c 5 ó 10 mM, PZ 100 mM, H2O2 0,5 mM. La reacción se inició con la adición del peróxido de hidrógeno, midiéndose luego el D de absorbancia a 518 nm durante 10 ó más min.

La concentración de FTZ-SO se midió espectrofotométricamente en la mezcla de reacción que contenía lo indicado para la medida del radical PZ+., excepto la FTZ indicada. La determinación del D de absorbancia y los coeficientes de extinción, e40,41se indicaron anteriormente.

Los espectros de emisión de fluorescencia se registraron en el espectrofluorómetro Aminco SLM 8000 C, con 325 nm de excitación, a 1, 10, 20 ó más min de incubación, en la mezcla de reacción como para la determinación espectro-fotométrica, excepto que el volumen total fue de 2,0 ml. El espectro de emisión de los estándares de PZ-SO, CPZ-SO y PMTZ-SO se registraron en los experimentos correspondientes.

Expresión de Resultados: La inactivación de la LADH por el sistema cit c/H2O2/FTZ , I(%); la protección de la enzima, P (%); los valores presentados y el análisis estadístico se expresan de acuerdo a lo indicado previamente14.

RESULTADOS

Actividad Peroxidasa del citocromo c.: La actividad peroxidasa fue de 1,8 ± 0,10 mM de H2O2 consumido por min/mmol de cit c, utilizando como sustratos guayacol 13 mM y H2O2 2,5 mM. Esta actividad es baja comparada con la actividad peroxidasa de la Mb que, determinada en las mismas condiciones, fue de 21 ± 2 mmoles de peróxido de hidrógeno consumido por min/mmol de Mb. Como la actividad peroxidasa depende de la unión del peróxido al Fe del grupo hemo, la reducida actividad del cit c ha sido explicada por la hexacoordinación del Fe del hemo y el escaso acceso del H2O2 al Fe19,23,46. El sexto ligando Met80 puede ser desplazado por diversos factores y se ha propuesto que el peróxido puede desplazar al ligando Met con formación del radical ferrilporfirina y rápida oxidación de un residuo de tirosina23.

La Figura 2 muestra la cinética de la formación del producto de la acción peroxidasa del cit c, con una fase inicial de activación < de 10 min, cuya duración disminuye con el aumento de la concentración de H2O2; luego, una fase "estable" representada por la parte recta de la curva y, finalmente, una zona con disminución notable de la formación del producto. Estas tres fases se indican en la Figura 2 como a (activación), b (fase estable) y c (inactivación) para la reacción cit c/guayacol en presencia de H2O2 1,5 mM. Esta última parte de la curva ha sido explicada, por lo menos en parte, por la inactivación del catalizador 34,47. La velocidad de la reacción del citocromo c en el estado "estable" tiene dependencia lineal de la concentración de H2O2 y aún a 20 mM de peróxido no se observó saturación (resultados no mostrados), dependencia similar a la encontrada para el cit c de miocardio equino (47). El inserto de la Figura 2 muestra que la duración de la fase de activación también disminuye con el aumento de la concentración del cit c, mientras que la velocidad de la peroxidación aumenta. Considerando estos resultados hemos usado la concentración de cit c 5 mM y H2O2 0,5 mM, para prevenir la inactivación del cit c dependiente del peróxido y lograr una mayor duración de la fase lineal de la actividad peroxidasa.



Figura 2. Actividad peroxidasa del citocromo c: Dependencia de la concentración del H2O2. La mezcla de ensayo contenía solución de fosfatos (K) 50 mM, pH 7.4, guayacol 13 mM. cit. c 5 mM y H2O2 0.25-20 mM según se indica en la Figura. La actividad peroxidasa se determinó midiendo el tetraguayacol formado. Los resultados corresponden a un experimento típico. En ausencia de peróxido de hidrógeno no se observó modificación del guayacol hasta los 30 min de incubación (no mostrados). Otras condiciones se describen en Material y Métodos. Inserto: Dependencia de la concentración de cit. c . La mezcla de reacción contenía solución de fosfatos (K) 50 mM, pH 7.4 , guayacol 13 mM, cit. c .0, 2, 5 ó 10 mM según se indica, y H2O2 0.5 mM. La actividad peroxidasa se determinó durante 60 min, midiendo el producto como en el experimento anterior.

FTZ como sustratos del sistema cit c/H2O2: La Figura 3 A y B muestra que la PZ es sustrato del sistema cit c/H2O2 determinando, espectrofo-tométricamente, el radical PZ+. producto de la reacción, por el aumento de la absorbancia a 518 nm44. Como se puede apreciar en la Figura, la fase inicial de la formación de PZ+. corresponde a la fase de activación del cit c observada durante la reacción de peroxidación del guayacol (Figura 2). La cinética de producción de PZ+. resulta de dos reacciones opuestas: a) La peroxidación de PZ por el sistema cit c/H2O2 (reacciones 3 y 4). b) La transformación del radical PZ+. por dismutación principalmente (reacción 2). La Figura 3 A (curva GSH 0) y B (curva Tyr 0) muestran la relativa estabilidad del radical PZ+.13,45,48. La Figura 4 muestra que la PZ es sustrato del sistema cit c/H2O2 mM, midiendo el PZ-SO resultante de la dismutación del radical PZ+., producto de la reacción peroxidasa13,40. En la misma Figura 4 se observa que la velocidad de la reacción se duplica (de 35 mM a 68 mM de PZ-SO formado en 30 min de incubación) al duplicar la concentración de cit c (de 5 mM a 10 mM ) y que la fase de activación es de menor duración cuando la concentración de cit c aumenta. Experimentos similares demostraron la formación de sulfóxidos con TRDZ, CPZ, PPZ, TFP y TFPZ en presencia de cit c/H2O2 (comunicación personal).



Figura 3. Producción de radical PZ+. por el sistema cit c/H2O2/PZ. A. Efecto del GSH. La mezcla de reacción contenía fosfatos (K) 6.5 mM, PZ 100 mM, cit c 5.0 mM, H2O2 0.5 mM, en ausencia (GSH 0) o presencia de GSH 0.2 mM (a). A una de las muestras sin GSH se añadió el tiol (GSH 0.2 mM) a los 10 min. de incubación (b) como se indica en la Figura. B. Efecto de la Tirosina y Metionina. Mezcla de reacción como en la Figura 3 A, excepto que en lugar de GSH se añadió Tyr 0.2 mM (b) o Met 0.2 mM a 10 min. de incubación ; ó Tyr 0.2 mM (a) un minuto antes del inicio de la reacción. Otras condiciones se describen en Material y Métodos.



Figura 4. Producción de PZ-SO por el sistema cit. c/H2O2/PZ. La mezcla de reacción contenía fosfatos (K) 50 mM, pH 6.5, PZ 100 mM, cit. c 0, 5 ó 10 mM según se indica en la Figura, y H2O2 0.5 mM. La producción de PZ-SO se midió por el aumento de la absorbancia a 341 nm. El tiempo de incubación se indica en la abscisa. Otras condiciones en Material y Métodos.

La Figura 5 muestra la cinética de formación del producto de la reacción peroxidasa con PMTZ, diferente a la de la PZ, con un período de activación breve y rápida producción de PMTZ-SO, obteniéndose en < de 8 min 75 mM de PMTZ y luego detención de la formación del producto. La Figura 5 también muestra que la ausencia de cit c previene la formación del sulfóxido, y que la adición de GSH cambia la cinética de la reacción, disminuyendo la producción de PMTZ-SO en concordancia a lo observado anterior-mente13, pues los tioles previenen la dismutación de los radicales FTZ+. a FTZ-SO, debido a la reacción del tiol con el radical catiónico (reacción 5).



Figura 5. Producción de PMTZ-SO por el sistema cit. c /H2O2/PMTZ. La mezcla de reacción contenía fosfatos (K) 50 mM, pH 6.5, PMTZ 100 mM, cit. c 5 mM, H2O2 0.5 mM (SC, sistema completo) y GSH 0.2 mM, según se indica en la Figura. La muestra control no contenía cit.c (-cit. c). La PMTZ-SO se midió por el aumento de la absorbancia a 335 nm El tiempo de incubación se indica en la abscisa. Otras condiciones se describen en Material y Métodos.

La Figura 6 y su inserto muestran los espectros de fluorescencia de los productos de peroxidación de PMTZ y PZ, respectivamente, por el sistema cit c/H2O2, que se identificaron con el estándar del respectivo sulfóxido.

Inactivación de la LADH de T c por sistemas cit c/H2O2/FTZ: La LADH fue inactivada por sistemas cit c/H2O2/FTZ de acuerdo al tiempo de incubación y a la estructura de la FTZ. La Tabla 1 y la Figura 7 A y B, resumen el efecto de diferentes FTZ como sustratos del cit c/peróxido sobre la actividad LADH de T c. TRDZ y PZ constituyeron los más efectivos sistemas con 53% y 43% de inactivación de la LADH, respectivamente, después de 30 min de incubación. El efecto de estas dos FTZ fue similar después de 60 min de reacción (Tabla 1), pero al finalizar 90 min (Tabla 2, primera columna, y Figura 7 A y B) la PZ produjo mayor inactivación (82%) que la TRDZ (76%). TMPZ y CPZ tuvieron menor efecto (72% y 68% de inactivación, respectivamente, a 90 min de incubación) (Tabla 2) Las otras FTZ fueron mucho menos eficaces, con inactivaciones entre 49% (PCP) y 15% (PCYZ), después de 60 min de incubación (Tabla 1). La omisión de FTZ en la mezcla de reacción evitó la inactivación de la LADH, lo cual descarta una acción directa del cit c/H2O2 sobre la enzima del parásito. Así mismo, la exclusión del cit c de la mezcla de reacción previno el efecto inactivante, indicando la necesidad de cit c como catalizador de la peroxidación en los sistemas estudiados. Por otra parte, cuando la PZ fue sustituída por PZ-SO 100 µM, en la mezcla de reacción, la inactivación de la LADH fue de 6 ± 1% después de 90 min de incubación, lo cual indica ausencia de efecto del sulfóxido/cit c/H2O2 sobre la actividad de ésta enzima. En un trabajo previo13, la PZ-SO 100 mM en un sistema peroxidásico no mostró efecto inactivante sobre la TR de T c, mientras que la PZ 10 mM, en un medio similar, inactivó completamente a esa enzima en 15 min.





Figura 6. Espectros de emisión de fluorescencia del producto de oxidación de la PMTZ por el sistema cit. c/H2O2. La mezcla de reacción contenía fosfatos (K) 50 mM, pH 6.5, PMTZ 100 mM, cit. c 5 mM, , H2O2 0.5 mM. La muestra control no contenía H2O2. Los espectros de emisión de fluorescencia se registraron a 20 y 30 minutos de incubación con excitación de 325 nm. Otro control PMTZ/H2O2 (cit. c omitido) no presentó este espectro (no mostrado).El espectro de emisión del producto de la oxidación de la PMTZ por cit. c/H2O2 presenta la máxima fluorescencia a 382 nm como el espectro de emisión de la PMTZ-SO. Otras condiciones se describen en Material y Métodos. Inserto: Espectros de emisión del producto de oxidación de la PZ por el sistema cit.c/H2O2 a 20 y 30 min de incubación y del control sin H2O2 a 30 min, obtenidos con excitación de 325 nm. Los espectros del sistema completo tienen características del espectro de emisión de la PZ-SO, con la máxima fluorescencia a 384 nm.





Figura 7. Cinética de la inactivación de la LADH de T. cruzi por los sistemas cit c/H2O2/FTZ. La mezcla de inactivación contenía LADH 0.8 mM, cit. c 5 mM,H2O2 0.5 mM, fosfatos (K) 50 mM, pH 7.4, y FTZ 100 mM según se indica: A Fenotiazinas con grupo 3- dimetil-amino-propil en N 10 (PZ,CPZ,PPZ y TFPZ). B. Con grupos 2-metil-3-dimetil- amino propil (TMPZ) o 2-dimetil-amino-propil (PMTZ); o con grupos piperidinil (TRDZ o PCYZ). Tiempo de incubación como se indica en la abscisa. Los valores representan la media ± D.E. (n= 3-5). Los controles en ausencia de FTZ o en ausencia de cit. c para el sistema TMPZ/H2O2, se presentan en A y B, respectivamente. La omisión de cit. c para los sistemas con las otras FTZ, o la omisión de H2O2, también previnieron la inactivación de la enzima (no mostrados).

La relación estructura-actividad muestra que a pesar de las diferencias estructurales, la PZ (con grupo dimetilamino en C3 de la cadena propil en la posición N 10) y la TRDZ (con grupo piperidinil en N 10 y SCH3 en la posición 2) poseen el más alto efecto inactivante de la LADH, mientras que la PMTZ, con mayor parecido estructural a la PZ (posee el grupo dimetilamino en C2 de la cadena propil en N 10 )tiene menor efecto inactivante, 47%, sobre la LADH, que representa el 57% del nivel alcanzado con la PZ. CPZ, PCP y PFZ, estructuralmente relacionadas por tener Cl en la posición 2 del núcleo de la FTZ, mostraron mayor efecto inactivante sobre la LADH que los compuestos con el grupo CF3 en la posición 2 del núcleo, FFZ, TFP y TFPZ. (Tabla 1). Estas últimas, y también la PPZ y PCYZ (Figura 7, A y B) tuvieron un período de latencia más prolongado antes de ejercer su efecto inactivante.

Protección de la LADH de T c frente a los radicales FTZ+.: La Tabla 3 muestra que los compuestos tiol previnieron totalmente la inactivación de la LADH hasta los 30 minutos de incubación, pero después de 60 min. la protección por GSH y PAM fue sólo parcial, 64% y 74% respectivamente. NAC y CPT fueron más efectivos con 100% y 93% de protección a los 60 min. Entre los compuestos tiol, el GSH presentó el menor efecto protector, 16% a los 90 min de incubación (Figura 8). La adición de GSH 0,2 mM a una muestra de LADH de T c, inactivada durante 60 min por el sistema cit c/H2O2/PZ, según el procedimiento descrito en la Tabla 3, no restauró la actividad de la LADH lo que sustenta el efecto inactivante irreversible de los radicales PZ+-. En la Tabla 3 se observa que la tirosina y sus péptidos poseen notable efecto protector, mientras que el triptofano efecto sólo fue discreto (20% y 11% de proteción después de 30 y 60 min, respectivamente). La Tabla 3 también muestra que el NADH previno totalmente la inactivación de la LADH por el mismo sistema peroxidativo después de 30 min de incubación, pero este efecto fue mucho menor, 21%, (Tabla 3) a los 60 min y 9% a los 90 min de incubación (Figura 8). Ascorbato y trolox fueron los mejores protectores de la LADH, como en el estudio con el sistema MPO/H2O2/TRDZ (14). Para los experimentos de protección en el presente estudio se usó PZ, pues fue la FTZ con mayor efecto inactivante y por que la velocidad de trans-formación del radical PZ+. es relativamente lenta (Figura 3 A y B)14,45,48.





Figura 8. Efecto de compuestos tiol y del NADH sobre la inactivación de la LADH de T. Cruzi por el sistema cit.c/H2O2/PZ. Condiciones experimentales en la leyenda de la Figura 7, con PZ 100 mM (SC, sistema completo). La mezcla de inactivación contenía, además, GSH, PAM, NAC o NADH 0.2 mM según se indica en la Figura. La reacción se inició añadiendo H2O2. El control de SC (H2O2 omitido) no tuvo efecto sobre la actividad de la enzima durante el experimento. (resultados no mostrados). Tiempo de incubación se indica en la abscisa. Otras condiciones según se describe en Material y Métodos. Los valores de P fueron < 0,001 (NAC y PAM), < 0,005 (GSH) y < 0,01 (NADH), a los 90 min de incubación.

Protectores de la LADH como supresores de radicales FTZ+.: La Tabla 4 muestra que los compuestos GSH, Cys, NAC, Tyr y Trp determinaron rápida disminución de la concentración del radical PZ+. generado por el cit c activado. La Figura 3 A (b) y B (b) también muestran que el GSH y la tirosina, respectivamente, produjeron rápida caída del nivel de PZ+. cuando se añadieron a los 10 min de iniciada la reacción de la fenotiazina con cit c/H2O2, pero la L Metionina no causó significativa variación de la concentración de PZ+. (Figura 3B, Met) Las Figuras 3 A (a) y B (a) muestran que el GSH y la tirosina, respectivamente, presentes desde un minuto antes del inicio de la reacción, tuvieron efecto inhibidor de la formación del radical PZ+. Resultados similares se obtuvieron cuando el NADH, trolox o ascorbato reemplazaron al GSH en la reacción con el radical PZ+. ya formado (Tabla 4) o en la reacción de formación de éste radical (no mostrados).


Comparación entre la inactivación de la LADH de T c y de mamífero: La probable diferencia entre la inactivación de la LADH del parásito y la del huésped, fue estudiada comparando la interacción entre la LADH del T c y la enzima de mamífero con varios sistemas cit c/H2O2/FTZ. La Tabla 2 muestra que la inactivación de la LADH de T c fue de 1,8, 1,9 y 2,1 veces la inactivación de la enzima de mamífero, con PZ, TRDZ y TMPZ, respectivamente. La CPZ y PMTZ presentaron efecto inactivante aún mayor frente a la LADH de T c, con una relación de efecto LADH T c/LADH de miocardio de 2,7 y 3,3 respectivamente.

La mezcla de inactivación contenía LADH de T. cruzi 0.8 mM o de miocardio 1.0 mM ; cit c 5 mM ; H2O2 0.5 mM; FTZ 100 mM ; y fosfatos (K) 50 mM, pH 7,4. Tiempo de incubación 90 min. Otras condiciones experimentales según Material y Métodos. Los valores representan la media ± D. E. (n = 3) de la inactivación de la LADH (%).

La mezcla de inactivación contenía LADH 0.8 mM, cit c 5 mM, H2O2 0.5 mM, PZ 100 mM, fosfatos (K) 50 mM, pH 7.4 y antioxidante 0.2 mM según se indica en el Cuadro. Los valores entre paréntesis indican la protección de la LADH (%). Otras condiciones se describen en Material y Métodos. P < 0,001 para todos los sistemas, excepto los marcados con un asterisco (* P < 0,005).

DISCUSIÓN

Aquí demostramos que el cit c posee actividad peroxidasa (Figura 2 e inserto) y que las FTZ son sustratos de esa reacción (Figuras 3-6). Es bastante conocido que los productos de la actividad peroxidasa con FTZ son los radicales libres catiónicos, FTZ+13,14,39,40,43-45.

En este. estudio la formación del radical PZ+. fue seguida directamente por espectrofotometría (Figuras 3 A y B; Tabla 4) y por su conversión a PZ-SO (Figuras 4 y 6, inserto). La generación de sulfóxidos en los sistemas oxidativos empleados, ocurre previa formación de radicales FTZ+., por lo cual la determinación cuantitativa e identificación de otros sulfóxidos como el de la PMTZ (Figuras 5 y 6) sustenta la peroxidación de estos sustratos por el sistema cit c/H2O2. Entonces, el cit c por su acción peroxidativa es un generador de FTZ+. Esta acción implica a) La formación de oxoferril cit c (reacción 3) que contiene radical tirosil23,26, estructuralmente similar al compuesto I de la HRP, de la hemoglobina y Mb39,49-51; y b) La generación de radicales FTZ+. (reacción 4).

cit c-FeIII + H2O2 ® cit c+.-FeIV=O + H2O (3)

cit c+.-FeIV = O + FTZ + H+ ® cit c+. - FeIII + FTZ+. + OH - ( 4 )

El ferril cit c es la especie activa32,33 que puede iniciar la peroxidación de lípidos, y que oxidaría a diversas moléculas27-32,34,35, incluyendo FTZ con generación de radicales FTZ+..

En este trabajo se demuestra que las FTZ, previa oxidación a radicales libres FTZ+. por el sistema cit c/H2O2, reaccionan con la LADH de T c inhibiéndola irreversiblemente (Tabla 1; Figura 7 A y B). El rol inactivante de los radicales FTZ+. se sustenta en: a) El requerimiento de un catalizador de la reacción peroxidasa, cit c en este estudio, y la participación del H2O2. Las FTZ (14) y los sistemas H2O2/FTZ y H2O2/cit c carecieron de efecto inactivante significativo (Tabla 1; Figuras 7 A y B). b) La detección y determinación cuantitativa de PZ+. (Figuras 3 A y B) así como en la medida de los sulfóxidos derivados por dismutación de éstos radicales, (Figuras 4 y 5) y los espectros de emisión de fluorescencia de FTZ-SO resultantes de la reacción 2 (Figura 6 e inserto). c) El efecto protector del GSH, NAC, Cys, NADH y otros supresores de radicales libres, frente a la inactivación de la LADH por cit c/H2O2/PZ (Tabla 3 , Figura 8). d) El efecto de los protectores de la LADH sobre los niveles de PZ+. (Tabla 4, Figuras 3 A y B ).

El efecto inactivante de las FTZ sobre la LADH de T c fue en el siguiente orden: PZ>TRDZ > TMPZ > CPZ > PCP > PFZ, PMTZ, PPZ. Las otras FTZ tuvieron discreto efecto (Tabla 1). La actividad del sistema cit c/H2O2/FTZ, como en otros sistemas peroxidásicos14 dependió de la estructura de las FTZ. PZ y TRDZ presentaron la mayor actividad inhibitoria y aunque son estructuralmente diferentes, el grupo sustituyente en la posición 10 de la TRDZ puede considerarse como un derivado cíclico del respectivo grupo de la PZ. La TMPZ presentó alto efecto inactivante y su grupo sustituyente en N 10 es análogo al de la PZ. Sin embargo, la PMTZ con una estructura bastante similar a PZ y TMPZ (Figura 1 A) tuvo menor efecto inactivante (Tabla 1 y Figura 7 B), que parece depender del número de átomos de C ( PZ y TMPZ, n=3; PMTZ, n=2)entre el átomo de N del sustituyente y el N 10 del núcleo FTZ (Figura 1 A y Ref. 45). En la Figura 8 A se observa que el efecto inactivante sobre la LADH es en el orden:

PZ > CPZ > PPZ > TFPZ

en relación inversa con la propiedad de captar electrones inherente a los sustituyentes en la posición 2 del anillo heterocíclico de las FTZ. Así, la TFPZ que en la posición 2 tiene el grupo CF3 con fuerte poder de captación de electrones, presentó el menor efecto inactivante sobre la LADH (Figura 8 A). Esta propiedad de los sustituyentes en la posición 2 puede explicar el mayor efecto inactivante sobre la LADH de las FTZ con Cl en la posición 2 (Figura 1 A y C) que las FTZ con CF3 en la misma posición (Tabla 1 y Figura 7 A), así como el alto efecto inactivante de la TRDZ (Tablas 1 y 2: Figura 7 B), cuyo grupo tiometil en la posición 2 (Figura 1 B) tiene débil poder de atracción de electrones. La influencia de los sustituyentes sobre la actividad de las FTZ si bien puede depender del diferente acceso de estos sustratos al sitio hidrofóbico en que se encuentra el hemo del cit c, como en el caso de los sustratos de la MPO52, la estabilidad del radical catiónico es un factor determinante, la cual depende de la estructura de los sustituyentes en las posiciones 2 y 1045 y de la interacción de ambos con el núcleo de las FTZ48. El radical PZ+. es más estable que los radicales TRDZ+.13, CPZ+. (43) y PMTZ+.45, en concordancia con sus actividades frente a la LADH de T c (Figura 7 A y B; Ref14).



Figura 1. Clasificación y estructura de las fenotiazinas. Sustitu-yentes en posición 10: A. Con grupo alquila-mina alifático (3-dimetil-aminopropil o deriva-dos) B. Con grupo piperidinil. C. Con grupo piperazinil.

Los compuestos tiol tienen efecto protector de la LADH frente al sistema cit c/H2O2/PZ (Tabla 3, Figura 8), similarmente a lo observado en otros sistemas peroxidasas, MPO, HRP y Mb14. La reacción de los radicales FTZ+. con compuestos tiol ha sido anteriormente estudiada17,53 y su efecto protector confirma el rol de FTZ+. en la inactivación de la LADH. El efecto del GSH como desactivante de radicales PZ+. (Figura 3 A, línea (b) se explica porque el radical PZ+. actúa como aceptor de un electrón del anión glutatión, formándose el radical glutatiilo y la molécula neutra PZ, a pH fisiológico o valores de pH aún mayores (reacción 5).

GS- + PZ+. « GS. + PZ (5)

La reacción inversa de transferencia de un electrón de PZ a GS. solamente ocurre en medios de pH muy ácido. La producción de radicales tiílo potencialmente citotóxicos y el consumo de GSH, con el consiguiente desbalance redox y predominio de la forma oxidada, son mecanismos de la acción del GSH y otros compuestos tiol como supresores de radicales FTZ+. El efecto transitorio del GSH como protector de la LADH (Figura 8) puede explicarse, por lo menos en parte, por la concentración relativamente pequeña del GSH empleada y su consumo durante los primeros 45 min de incubación. El efecto inhibidor de la formación de radicales PZ+. observado en la Figura 3 A línea (a) puede explicarse, en parte, por la competencia entre PZ y GSH por el cit c activado, pues recientemente se ha demostrado que el GSH es oxidado por el grupo oxoferril del compuesto I del cit c33.

La L Tirosina y sus péptidos, y el L Triptofano, fueron protectores de la LADH de T c (Tabla 3). En concordancia con este efecto, la tirosina añadida un min. antes del inicio de la reacción, inhibió la producción del radical PZ+. (Figura 3 B, curva a), y cuando la tirosina se añadió al obtener la máxima concentración de PZ+., ésta disminuyó abruptamente (Tabla 4 y Figura 3B, línea b). El efecto inhibidor(a) puede explicarse por la demostración de que las FTZ (Figuras 3 A y B-6) y la tirosina son sustratos del cit c activado.En la reacción de la tirosina se forma eficientemente el radical tirosil (reaccion 6) (comunicación personal) determinado por la fluorescencia de su dímero, la ditirosina (reacción 7), como en la reacción catalizada por peroxidasas 54,55.

Tyr + cit c+.-FeIV =O ® Tyr + cit c+.-FeIII + OH (6)

Tyr. + Tyr. ® Tyr-Tyr (7)

Entonces, FTZ y Tyr pueden ser sustratos competitivos del cit c en su reacción con el peróxido, con el resultado de la prevención de la peroxidación de las FTZ por la Tyr. El efecto supresor del radical PZ+. demostrado en la Figura 3B (b) puede ocurrir en la siguiente reacción:

Tyr + PZ+. ® Tyr. + PZ (8)

Esto es, el radical PZ+. generado por oxidación previa de la PZ por el cit c activado, oxida a un compuesto secundario (Tirosina) produciendo el respectivo radical (Tirosil).Esta interpretación se basa en la propiedad de las FTZ de actuar como mediadores redox56-58, por su carácter de oxidantes fuertes frente a compuestos reductores como los aminoácidos aromáticos Tyr y Trp. Por otra parte, la tirosina libre59 o formando parte de proteínas de membrana60, o de péptidos hor-monales61 puede actuar como eficiente antioxi-dante fisiológico. Al respecto, el péptido TyrGly se comportó como protector de la LADH de T c (Tabla 3), en concordancia con la propiedad antioxidante de polipéptidos NH2-TyrGly-como la Leu y Met encefalinas61.

En la reacción del cit c con el peróxido de hidrógeno se ha demostrado que después de la generación del radical centrado en la proteína del cit c, éste puede ser transferido a un nonapéptido que contiene triptofano y a otras moléculas26, y en relación al Trp se ha demostrado que el FSHRF-factor liberador de la hormona folículo estimulante- posee actividad antioxidante como interceptor de radicales libres, dependiente de los dos residuos de Trp de su molécula61. Entonces, el efecto protector del Trp hacia la LADH, podría explicarse por la acción competitiva del Trp frente a la PZ por el cit c activado, así como por el efecto supresor del radical PZ+. por el Trp (Tabla 4); éste último efecto según la reacción:

Trp + PZ+. ® Trp. + PZ (9)

estaría de acuerdo a los potenciales redox del par PZ+. /PZ, 0,71 V62 y del sistema Trp., H+/Trp, 1,02V.

En general, proteínas y péptidos con residuos Tyr o Trp son los receptores más sensibles en el proceso de transferencia de radicales libres desde hemoproteínas26,51, proceso que sería de múltiples consecuencias biológicas. Así mismo, es de destacar que una especie reactiva de la Mb, con un centro activo similar al del cit c activado, interactúa mayormente con Tyr, Trp y Cys libres51. Resumiendo, los efectos de los compuestos tiol, Tyr y Trp sugieren que los radicales FTZ+. reaccionan con el grupo SH de la Cys y los residuos de Tyr y Trp de la LADH, inactivándola.

La protección de la LADH por NADH frente a radicales PZ+. (Tabla 3; Figura 8) fue transitoria, y la máxima protección observada hasta 30 min del inicio de la reacción está en relación con el mayor efecto sobre la concentración del radical. La disminución brusca de la concentración de PZ+. (95%) fue obtenida al añadir NADH cuando el radical catiónico alcanzó el más alto nivel (Tabla 4). El NADH es oxidado rápidamente a NAD. por radicales libres o moléculas aceptoras de un electrón con adecuados potenciales de reducción63. El potencial redox del sistema NAD., H+/NADH es de 0,3 V 64 y el del par.

PZ+./PZ es de 0,71 V, luego la siguiente reacción puede ocurrir, con una constante de velocidad, k = 5 x 105 M-1 s-1 65:

NADH + PZ+. ® NAD. + H+ + PZ (10)

donde el radical PZ+. oxida al NADH generando NAD. y la molécula neutra PZ. El radical NAD. reacciona fácilmente con el oxígeno molecular(k= 1,9 x 109 M-1 s-1)66 generando anión superóxido y NAD+. La reacción 10 indica la función antioxidante directa del NADH, de especial importancia a nivel mitocondrial65. Sin embargo, NAD. y anión superóxido son potencialmente citotóxicos. Recientemente se demostró que el NADH y otros sustratos pueden ser oxidados por el intermediario tipo compuesto I del cit c33, y aunque en nuestro estudio la velocidad de oxidación del NADH por cit c /H2O2 fue solo de 1,2 mM/min (no mostrado), no puede descartarse un efecto del NADH como inhibidor de la peroxidación de FTZ, actuando competitivamente frente al cit c activado. Al reemplazar el cit c por una peroxidasa, el consumo de NADH durante la reacción fue seguido por reanudación de la formación del radical PZ+.14, lo cual explicaría la disminución del efecto protector observado al prolongar el tiempo de incubación (Figura 8). Estas observaciones sugieren un nuevo estudio del efecto del NAD. y del anión superóxido sobre la inactivación de la LADH por el sistema cit c/H2O2. El ascorbato y el trolox (análogo soluble de la vitamina E), fueron los mejores protectores de la LADH frente al radical PZ+. generado en el sistema cit c/H2O2 (Tabla 3). Este efecto concuerda con la gran capacidad de estos compuestos para desactivar radicales FTZ+. (Tabla 4), formando la FTZ original y el radical ascorbil17,53,62, o el radical fenoxilo del trolox14.

Estudios previos han sugerido que el ascorbato es sustrato del cit c activado26,33, y en las condiciones del presente trabajo hemos demostrado la interacción cit c/peróxido con el ascorbato en ausencia y presencia de PZ (comunicación personal); y siendo el trolox sustrato de peroxidasas67, es un posible sustrato del intermediario reactivo del cit c. Entonces, la inhibición de la formación de PZ+. cuando el ascorbato o el trolox estuvieron presentes en el sistema experimental antes de iniciar la reacción con el H2O2, puede explicarse, en parte, por la participación de estos antioxidantes como sustratos competitivos de las FTZ por el cit c.

Por otra parte, este estudio revela mayor susceptibilidad de la LADH de T c en comparación con la enzima de mamífero, lo cual sustenta la hipótesis de considerar la enzima del parásito como blanco para el diseño de fármacos específicos3 estructuralmente relacionados a las FTZ. Estas observaciones realizadas con sistemas cit c son concordantes con los resultados encontrados en otros sistemas generadores de radicales FTZ+., MPO/H2O2 (14) y HRP(Mb)/H2O2 (comunicación personal).

El T c es fagocitado por los macrófagos y puede penetrar en otras células, incluyendo células musculares del miocardio y del sistema retículo endotelial10,68,69. El tratamiento con CPZ o TFPZ de cardiomiocitos infectados con T c alteró la membrana plasmática y los microtúbulos subpeliculares del parásito intracelular8. La PMTZ también desorganiza las membranas celulares de tripomastigotes de T c70, y la TFP9 y TRDZ10 generan lesiones mitocondriales del parásito, lo cual puede implicar acciones de las FTZ desde el interior del T c y de las células huésped. La peroxidación de las FTZ, especialmente PZ, TRDZ y TMPZ, podría ocurrir por el cit c de las células huésped y del T c si se alcanzan apropiadas concentraciones "in situ" de H2O2.. La acción del cit c sería a nivel mitocondrial o citoplasmático; en este último compartimiento por el cit c liberado durante la apoptosis que puede ocurrir en el curso de la infección con T c71. El cit c del T c72,73 y la actividad peroxidasa de las mitocondrias de tripanosomátidos han sido estudiados74, y ésta actividad puede atribuírse al cit c del parásito. Es interesante anotar que la oxidación del cit c por cloramina-T75 o por HOCl, HOBr, y HOI-76 metabolitos de los neutrófilos activados- cambia sus propiedades redox, habiéndose observado, además, aumento de la actividad peroxidasa del cit c especialmente por la reacción con HOCl77, por iodinación, por nitración con peroxinitrito78 y otros factores79,80. El aumento de la actividad cit c peroxidasa ocurre por desplazamiento del sexto ligando de coordinación Fe Hemo-Met80, con oxidación de ese residuo de Met, disfunción del cit c en el transporte de electrones y, posiblemente, aumento de la generación de anión superóxido y de H2O277. Previamente se había establecido que la interrupción del flujo de electrones a nivel del cit c en la cadena respiratoria mitocondrial durante la apoptosis, aumenta la producción de radicales superóxido y su dismutación a H2O2 y O2 (20). El sistema cit c/H2O2/FTZ puede ser una causa potencial del efecto tripanocida de las FTZ, y aunque los interceptores de radicales FTZ+. -GSH, Tyr, Trp, NADH y otros compuestos-, pueden prevenir la inactivación de la LADH T c, generan radicales secundarios potencialmente citotóxicos y disminuyen la concentración de estos importantes metabolitos celulares. En conjunto, estos efectos pueden desempeñar un rol destacado en la acción anti-T. cruzi y en otras manifestaciones farmacológicas de las FTZ.

Abreviaturas: LADH,dihidrolipoamida deshidrogenasa; T c,Trypanosoma cruzi; citocromo c, cit c; MPO, mieloperoxidasa; Mb, mioglobina; FTZ, fenotiazina, dibenzotiazina;PZ, promazina,10-(3-dimetilaminopropil)-FTZ;CPZ,cloropromazina,2-cloro-10-(3 -dimetilamino propil)-FTZ; PPZ, propionil-promazina, 2-propionil-10-(3-dimetilami-nopropil)-FTZ; TFPZ, trifluopromazina,2-trifluorometil-10-(3-dimetilamino propil)-FTZ; TMPZ, trimeprazina, 10-(2-metil-3-dimetilami-nopropil)-FTZ; PMTZ, prometazina, 10-(2-dimetilaminopropil)-FTZ; TRDZ, tioridazina, 2-metilmercapto-10-[2-(1-metil-2-piperidinil)-etil] -FTZ; PCYZ, propericiazina, 2 ciano-10-[3-(4 hidroxi-1 piperidinil)- propil]-FTZ; PCP, procloroperazina, 2-cloro-10-[3-(1-metil-4-piperazinil)-propil]-FTZ; PFZ, perfenazina, 2-cloro-10-[3-[1-(2-hidroxietil)-4-piperazinil]propil]-FTZ; TFP, trifluoperazina, 2-trifluorometil-10-[3-(1-metil-4-piperazinil)-propil]-FTZ; FFZ, flufenazina, 2- trifluorometil-10-[3-[1-(2-hidroxietil)-4-piperazinil] propil]-FTZ; NAC, N-acetilcisteína; PAM, penicilamina; CPT captopril;Trolox, 6-hidroxi 2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico.

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Agradecimientos: Este trabajo se realizó con apoyo de la Universidad de Buenos Aires y de su Hospital de Clínicas José de San Martín; de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos y de su Instituto de Medicina Tropical Daniel A. Carrión; de la Prof..Dr. R.L. Krauth- Siegel (Biochemie-Zentrum, Heidelberg University, Germany), quien contribuyó decisivamente con la enzima LADH T. cruzi ; y, de los Laboratorios Roemmers.

Correspondencia: Instituto de Medicina Tropical. Ciudad Universitaria (UNMSM). Av. Colonial Cdra 53. Lima- Perú. Fax (14) 51032. E-mail: josegutierrezc@speedy.com.pe

 

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