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Revista chilena de neuro-psiquiatría

versión On-line ISSN 0717-9227

Rev. chil. neuro-psiquiatr. v.41  supl.2 Santiago nov. 2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-92272003041200005 

ARTÍCULO ORIGINAL

Nuevos paradigmas en el estudio de la
patogénesis de la enfermedad de Alzheimer

New paradigms in the study of the
pathogenesis of Alzheimer’s disease

Cristóbal Maccioni, María E. Arzola, Lorena Mujica, Ricardo Maccioni

One of the greatest challenges in medicine during the past two decades has been to tackle the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Major advances have been made based onthe development of what we know today as modern molecular medicine. This neuropsychiatric disorder is characterized by the formation in the brain of two main types of protein aggregates: (i) neurofibrillary tangles, formed by the association of helical paired filaments, which are the product of the self-polymerization of the microtubule-associated protein tau (ii) ß-amyloid deposits of the Aß peptide that form senile plaques. The evidence accumulated in the last years emphasizes the role of hyperphosphorylations of tau protein at the intraneuronal level, as a central event in the pathogenesis of Alzheimer neurodegeneration. Recent investigations in our laboratory led to the discovery that the deregulation of the protein kinase system cdk5/p35 is determinant for tau hyperphosphorylations. These findings led to a series of investigations to explain the alteration that occurs in the cascade of molecular signaling leading to a loss of cdk5 regulation. Alterations in other protein kinases such as Gsk3ß have also been studied. Factors such as Aß deposition, oxidative stress and inflammatory processes have been shown to trigger major alterations, sometimes irreversible, in the normal signaling pathways, thus generating a dysfunction in brain neurons, especially in the hippocampus, eventually leading to neuronal death in the late stages of the disease. In this study, we analyze the relationship between the extraneuronal factors that determined the deregulation in protein kinase signaling pathways and the modifications of tau protein, a central paradigm in Alzheimer´s pathology.

Key words: Alzheimer’s disease, pathogenisis
Rev Chil Neuro-Psiquiat 2003; 41(Supl 2): 33-46

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) recibe este nombre gracias a las contribuciones científicas de Alois Alzheimer, en Munich hacia 1911, sobre un tipo de desorden neuropsiquiátrico. Las investigaciones de Alzheimer se basaron en establecer una correlación entre la sintomatología clínica de pacientes con este desorden y la aparición de estructuras anómalas en el cerebro de estos pacientes, denominados ovillos neurofibrilares (ONFs) (1). Se ha demostrado que estas estructuras no se encuentran en los cerebros post-mortem de sujetos controles de edad avanzada que no presentan esta enfermedad (2).

La EA es una de las demencias más comunes en el adulto mayor, afectando cerca de un 10-12% de la población mayor de 65 años. Dentro de los próximos 20 años, se estima que un número cercano a los 30 millones de individuos sufrirán esta enfermedad en el planeta si no se encuentra una cura para este desorden neurodegenerativo. Es por ello que la EA no sólo constituye un gran desafío científico sino que también involucra un enorme dilema psicosocial y ético, generando un impacto negativo en la economía de los países. Las investigaciones más recientes sobre la EA han confirmado que el proceso de degeneración neurofibrilar genera una disfunción de las células nerviosas, ocasionando en una etapa más avanzada la muerte selectiva de ciertas poblaciones neuronales, especialmente en regiones del hipocampo, corteza entorina y núcleos de Meynert (3, 4). Además, se produce una disminución en los niveles de ciertos neurotransmisores como la acetilcolina (5). Sin embargo, los mecanismos involucrados en la neurodegeneración y pérdida neuronal no han sido aún dilucidados.

La enfermedad de EA se caracteriza clínicamente por un proceso neurodegenerativo asociado a un deterioro progresivo tanto en las funciones cognitivas como en la memoria, confusión, desórdenes de la personalidad y en los estados de ánimo y desorientación entre otros. Mientras que a nivel histopatológico, se caracteriza principalmente por la formación de dos tipos de agregados proteicos (6): los ovillos neurofibrilares (ONFs), que se localizan en el interior de la neurona y las placas seniles (PS), ubicadas en el espacio extracelular. Los ONFs comprenden una red filamentosa compacta formada por los filamentos pareados helicoidales (PHFs), los cuales constituyen agregados de la proteína tau hiperfosforilada (7, 8). Estas estructuras anómalas generan serios trastornos en la actividad neuronal, provocando una pérdida en su capacidad de transmitir mensajes nerviosos y ocasionando finalmente el proceso neurodegenerativo. Las placas seniles (PS) son lesiones multicelulares esféricas que contienen en el centro depósitos extracelulares de un péptido de 40-43 aminoácidos, denominado b amiloide (Ab). Este centro es rodeado por microglía, astrocitos activos y neuritas distróficas (8,9). Normalmente, Ab es producido a niveles muy bajos y la forma mayoritaria (90%) corresponde al péptido Ab 1-40, con una baja capacidad de agregación. Sin embargo, en EA el péptido Ab sintetizado corresponde al péptido Ab1-42/43, altamente hidrofóbico y con una estructura secundaria de lámina b que induce la formación de agregados (revisión en ref. 5). El péptido Ab proviene de un proceso proteolítico de la proteína precursora b amiloide (APP) (10, 11). APP es una proteína de transmembrana de tipo I que se transloca co-traduccionalmente en el retículo endoplasmático (RE) y que sigue la vía secretora hacia su localización en la membrana plasmática. A través de esta vía secretora, APP sufre una proteólisis por varias secretasas denominadas a, b y g, liberándose derivados secretados en vesículas luminales o al espacio extracelular. El péptido citotóxico Ab se produce por la acción conjunta de las secretasas b y g, las que son moduladas por las presinilinas 1 y 2 (PS1 y PS2) (12, 13). Estudios científicos con familias que presentan diferentes mutaciones en los genes codificantes de la proteína APP, PS1 y PS2 (14),que producen un aumento de la producción de Ab1-42 y que desarrollan EA en forma prematura, han llevado a postular que los depósitos extraneuronales de Ab constituyen un evento temprano en la patogénesis de la enfermedad (15). Sin embargo, no existe un consenso de cómo el depósito de Ab en el cerebro lleva a la demencia (16). Se ha postulado la participación de otros factores además del péptido Ab para desarrollar la enfermedad, entre los que se encuentran: (i) los procesos inflamatorios, como la liberación de interleuquinas 1 y 6 (IL-1 y IL-6) por la glia y (ii) el estrés oxidativo y la acumulación de hierro en el cerebro. Por otro lado, en los últimos años se han estudiado múltiples factores de riesgo, entre los cuales se encuentran, la edad, la presencia del alelo Apoe4 y la sobreexpresión de la interleuquina-1 (IL-1).

La EA forma parte de una familia de desórdenes degenerativos del cerebro que tiene como denominador común la acumulación anómala de agregados de proteicos. Entre otros desórdenes degenerativos pertenecientes a esta familia se encuentran la enfermedad de Pick y las tauopatías frontotemporales del cromosoma 17 (HFTD-17), que se caracterizan por mutaciones en el gen que codifica la proteína tau (17), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) que implica alteraciones en los neurofilamentos, la enfermedad de Parkinson, producida por inclusiones de a-sinucleinas, entre otros factores y la enfermedad de Huntington, que se caracteriza por la expansión de dominios de poliglutamina en una proteína denominada huntingtina.

Por ello es importante conocer y entender en profundidad los mecanismos de agregación anormal de las proteínas en el cerebro, y desarrollar enfoques que sean capaces de prevenir o al menos retardar esta agregación y la posterior neurodegeneración, lo cual tiene una gran importancia biomédica hacia el tratamiento de esta enfermedad.

La hiperfosforilación de tau es determinante
en la enfermedad de Alzheimer

Los ovillos neurofibrilares (ONFs) constituyen la principal lesión intraneuronal encontrándose de preferencia en los cuerpos neuronales y dendritas apicales. En menor proporción se encuentran en dendritas distales, como los filamentos de la neuropila y en neuritas distróficas, que rodean los núcleos centrales de algunas placas del amiloide. Investigaciones recientes indican que un evento molecular determinante en la patogénesis de demencias tales como el Alzheimer es la formación y presencia de los PHFs (Figura 1). Otros desórdenes de importancia en esta enfermedad, como los depósitos de Ab no son suficientes para causar la EA (18). Los estudios del Prof. Alzheimer ya indicaban que las placas seniles se encontraban tanto en cerebros de pacientes con la enfermedad como en los controles seniles normales, lo que sugería que tales placas podrían ser marcadores de senilidad más que de demencia. En apoyo a esto, existe evidencia que la distrofia neurítica se correlaciona con la expresión de formas de demencia clínica y que los pacientes pueden tolerar ciertos niveles de amiloidosis, antes de presentar signos de disturbios cognitivos. La formación de PS es común en el envejecimiento normal, encontrándose rara vez ovillos sin la presencia de PS, por lo que se ha planteado que el depósito de Ab precede a la formación de ONFs (5,19). Sin embargo, es posible que la formación de PHFs y de PS, dos eventos celulares claves en la EA, produzcan en forma complementaria la pérdida de la actividad de las neuronas afectadas. Nuestro laboratorio ha contribuido a dilucidar la relación entre las PS de Ab extraneuronales y los eventos moleculares que llevan a la hiperfosforilación de tau en el interior de las neuronas (19). Además, hemos logrado comprender de qué manera tau llega a formar los PHFs (20). El péptido Ab induce alteraciones en la vía normal de señalización mediada por el sistema de la proteína quinasa Cdk5 activado por las proteínas p35 y p39, generando la hiperfosforilación de la proteína tau (21-23).


Figura 1. Microfotografías que muestran la organización de los ovillos neurofibrilares (ONF) mediante estudios de inmunocitoquímica y microscopía electrónica de la estructura de los filamentos pareados helicoidales (PHF) formados por la proteína tau hiperfosforilada. Abajo se muestra un esquema de los aminoácidos correspondientes a los sitios de fosforilación en la proteína tau (números pequeños) y los sitios anómalos de las hiperfosforilaciones (números grandes).

Modificaciones post traduccionales de tau
y su rol en la génesis de los PHFs

A partir del hallazgo de los PHFs, se ha planteado que existe una relación entre estas inclusiones y el citoesqueleto de la neurona, la red tridimensional de filamentos que conforman la arquitectura de todas las células eucarióticas (7). Los PHFs se forman a partir de la proteína tau. Tau, es una proteína asociada a los microtúbulos contribuyendo a la organización del citoesqueleto (24). En condiciones normales de la neurona, la proteína tau juega un papel fundamental en la modulación de la formación de los microtúbulos, polímeros esenciales para mantener la dinámica del citoplasma, los procesos de transporte en el interior de la neurona y en la formación del huso mitótico en células en división (25). Sin embargo, debido a una alteración en las señales reguladoras, por un mecanismo aún desconocido, la proteína tau se disocia de los microtúbulos formando agregados intracelulares (Figura 1) y produciendo una disfunción neuronal.

Para comprender las funciones de la proteína tau normal y patológica ha sido importante dilucidar su estructura y los mecanismos por los cuales se autoensambla. La tau humana contiene seis isoformas que resultan de un proceso de empalme ("splicing") alternativo (7). El dominio C-terminal contiene 3 ó 4 secuencias repetitivas involucradas en la unión de tau a los microtúbulos y que son claves para la capacidad de promover su ensamblaje (24). Estudios a nivel celular y molecular en nuestro laboratorio nos han permitido dilucidar la estructura de dominios de tau y localizar intracelularmente un grupo de isoformas de esta proteína, descubriendo así el papel esencial de polipéptidos de tau como mediadores de la interacción entre los diferentes filamentos que forman la citoarquitectura (26). De este conjunto de observaciones, se deriva una serie de interrogantes relacionadas con la generación de los PHFs y las bases moleculares de esta enfermedad: ¿cuál es la función de las diferentes isoformas de tau?, ¿cómo se asocian las moléculas de tau en la estructura de los PHFs?, ¿Existe una interacción a nivel de los dominios repetitivos de unión en tau que permitan explicar la formación de los PHFs?

Tau es una proteína altamente hidrofílica que contiene residuos aminoacídicos polares y cargados, la cual permanece en solución incluso después de tratamientos con calor y acidez. Sin embargo, al estudiar ciertos dominios de esta proteína, se ha demostrado que el dominio de repeticiones se autoagrega en forma más rápida que la proteína completa y que es este dominio que forma el centro de los PHFs (27). Incluso, se ha estudiado que la agregación puede acelerarse cuando tau es dimerizado por oxidación (28), por la adición de polianiones como heparina o RNA (29) o por la adición de ácidos grasos (30). Debido a la tendencia de tau de no formar estructuras secundarias ordenadas ha sido muy difícil dilucidar en qué principios estructurales estaba basada la agregación de tau. Sin embargo, recientemente se descubrió que la isoforma de tau adulta que contiene las cuatro repeticiones (incluyendo exón 10), presenta dos motivos hexapéptidos, PHF6 (306VQIVYK311) localizado en la repetición R3 y PHF6*(275VQIINK280) localizado en la repetición R2, capaces de inducir agregación de tau a través de la formación de interacciones entre láminas b (31), la cual es imposible de visualizar al estudiar la proteína completa. Además, se estudió que dos de las mutaciones encontradas en las demencias frontotemporales hereditarias que aceleran la formación de agregados de PHFs tienen una mayor tendencia a formar estructuras de lámina b cerca de los motivos hexapéptidos (31).

Una de las causas por las cuales se produce un cambio en la funcionalidad de tau es la fosforilación anormal en sitios importantes de su estructura, esencialmente en residuos Ser/Thr seguidos de Pro: Ser202, Thr205, Ser396 y Ser404 (22). Tales fosforilaciones son catalizadas por dos proteínas quinasas: el sistema cdk5/p35 y la Gsk3b (32). En el citoplasma celular, tau existe normalmente fosforilada y se postula que estas modificaciones post-traduccionales regularían la capacidad de tau para asociarse a los microtúbulos y a otros filamentos del citoesqueleto (19) (Figura 1). En la EA, tau se hiperfosforila en estos sitios claves, lo que cambia su dinámica de acción en la regulación de los patrones de interacción dentro del citoesqueleto provocando su autoasociación y formación, en forma progresiva, de los PHFs. En el cerebro fetal tau aparece también hiperfosforilada, y algunos sitios de fosforilación de la tau fetal se han encontrado también en los PHFs. Esto sugiere que la incorporación de tau a los PHFs se podría derivar de una alteración en los mecanismos que controlan su fosforilación, lo que llevaría a cambios conformacionales en esta proteína. Ello implicaría cambios en la regulación de la actividad de los sistemas de proteínas quinasas y fosfatasas específicas involucradas en esta modificación de tau. Los estudios de Mandelkow y colaboradores han indicado hacia la vía de la oligomerización de tau para formar dímeros, tetrámeros y finalmente polímeros de tau hiperfosforilada (28). Se han descrito hiperfosforilaciones de tau por la quinasa activada por mitógenos (MAPK) y otros sistemas que son capaces de fosforilar a la proteína tau expresada por recombinación génica y generar estructuras del tipo de los PHFs (33,34). Debido a la gran heterogeneidad de tau, Mandelkow y colaboradores han usado recombinantes de tau expresados en bacterias y construcciones obtenidas directamente por mutagénesis, las que han sido de utilidad en el análisis de las fosforilaciones (35). Estos estudios sugieren que la longitud estructural de tau estaría determinada por su dominio de ensamblaje y que los monómeros de la proteína tenderían a asociarse en forma antiparalela. Más interesante aún, construcciones de tau que contienen las secuencias repetitivas tienen toda la información para formar PHFs por sí mismos, aun sin mediar la fosforilación.

La organización estructural de las placas seniles (PS)

Los agregados de Ab recibieron este nombre debido a su tinción característica por colorantes que tiñen el almidón. En general las proteínas amiloides poseen un alto grado de conformación de estructura secundaria en lámina beta plegada. Entre estos ejemplos se encuentran la proteína amiloide del suero, la precalcitonina y la proteína de la fibra amiloide en los mielomas, relacionada con las cadenas livianas de la inmunoglobulina. Investigando la relación con las proteínas que forman los depósitos de Ab en cerebros de pacientes con la EA, se logró purificar de las meninges un péptido con una masa molecular de 4 kDa, cuyo anticuerpo reaccionaba con las PS en los pacientes con la EA (13, 36). La progresiva deposición anormal de Ab en el cerebro es una de las características neuropatológicas más relevantes en la EA (37). La secuenciación de la proteína Ab, permitió predecir que era un fragmento de una proteína precursora (APP) cuyo gen está localizado en el cromosoma 21 humano. Defectos en la segregación del cromosoma 21 dan lugar al síndrome de Down que posee también algunos aspectos clínicos relacionados con la EA. Por otra parte, se ha descrito que la agregación de Ab sería estimulada por la variante apoe-4 de la apolipoproteína E que aparece como un importante factor de riesgo genético en la EA (38, 39).

Cómo Aß afecta a la conducta de tau
y su hiperfosforilación por cdk5

Hallazgos de Busciglio y colaboradores (40) mostraron que las fosforilaciones anómalas en tau podrían ser inducidas por Ab, lo que traía consigo la pérdida de la capacidad de tau de unirse a microtúbulos (40). Sin embargo no quedaba claro que sistema enzimático era determinante en estas hiperfosforilaciones ni los mecanismos moleculares involucrados. Este hallazgo permitiría encontrar una vía de enlace entre los eventos que ocurren tras la agregación de Ab en cerebro y los cambios en la función de tau (5, 19). Como se ha indicado descubrimos que Ab gatilla la cascada de señales que involucra al sistema de la quinasa cdk5 y a su activador p35, lo que promovería el primer tipo de fosforilaciones anómalas en tau, seguido por hiperfosforilaciones en Ser396 y Ser404 por la kinasa Gsk3b. Cdk5 es una enzima clave en el proceso de migración neuronal durante el desarrollo del cerebro, además de participar en el proceso de desarrollo neurítico (19, 22, 23), en la estructura y plasticidad de la sinapsis, procesos de guía axonal y en fenómenos de adhesión celular (41). El tratamiento de células del hipocampo con concentraciones crecientes de Ab en su forma fibrilar incrementa los niveles de fosforilación en los epítopos Ser202 y Thr205, exponiendo estos fosfoepítopos de tau, los que son reconocidos por el anticuerpo AT8 que identifica a la tau del tipo Alzheimer en los PHFs. En este contexto, la demostración más directa del papel crítico de estas fosforilaciones en el proceso neurodegenerativo derivó de nuestros estudios con inhibidores de cdk5 (22). En estos estudios con células del hipocampo, se observó que al bloquear la actividad de esta enzima con inhibidores como roscovitina y butirolactona, se protegía a las neuronas de la muerte neuronal provocada por fibrillas de Ab (Figura 2). La desregulación de cdk5 ha sido corroborada además en ensayos in vivo, utilizando modelos transgénicos que sobreexpresan la proteína APP y que acumulan mayores niveles de placas de amiloide (42), así como en cerebros postmortem de pacientes con la EA (43). Los estudios inmunocitoquímicos en cerebro del ratón transgénico Tg2576, utilizando anticuerpos PHF1 y AT8, mostraron patología de tau del tipo Alzheimer, además de una marcada proliferación de la glia (Figura 3). Detallados estudios a nivel molecular demostraron que la sobreactivación de cdk5 se debía a la formación de un complejo altamente estable entre cdk5 y p35, como resultado de fosforilaciones en cdk5 por sistemas como la proteína quinasa dependiente de calcio y calmodulina o por caseína quinasa I (23). Además, en cerebros postmortem, se ha observado que la hidrólisis de la proteína de membrana p35 a p25 que se libera al citosol parece ser crucial en esta activación (34, 44). Sin embargo, estos estudios neuropatológicos no son dinámicos y no permiten evaluar el mecanismo de acción de p25 (42, 43). Un análisis en profundidad de las bases moleculares de esta activación se realizó recientemente (19).


Figura 2. Representación esquemática que muestra que la inhibición de la proteína quinasa cdk5 por butirolactona I (BT) protege a las neuronas de la neurodegeneración y muerte neuronal inducida por Aß. Abajo se muestra, a través de un análisis de viabilidad neuronal mediante inmunofluorescencia en un cultivo primario de hipocampo de rata, cómo la butirolactona I (BT) es capaz de proteger a las neuronas de la neurotoxicidad del Aß.


Figura 3. Inmunocitoquímica de proteínas del citoesqueleto neuronal en secciones del hipocampo del ratón transgénico Tg2576 que sobreexpresa la proteína precursora de amiloide (APP) y en ratones silvestres (controles) de la misma edad. Experimentos de inmunocitoquímica se realizaron usando anticuerpos contra la proteína tau del tipo Alzheimer (PHF1) (paneles A, B), y contra la proteína glial fibrilar acídica (GFAP) (paneles C, D). Por otra parte se realizaron experimentos usando el anticuerpo Tau5 que identifica todas las isoformas de tau (paneles E, F). Los paneles A, C, E corresponden al ratón transgenico, mientras que paneles B, D y F a un ratón normal (control).

Una vez que tau se ha hiperfosforilado y se acumula en las neuronas, se afecta el equilibrio entre quinasas y fosfatasas y éstas no logran revertir las modificaciones irreversibles en tau. A este nivel de progreso en la patogénesis de la neurodegeneración, la tau anormalmente modificada es substrato de reacciones de glicación no enzimática y de su oligomerización en agregados que constituirán los centros de nucleación para la formación de los PHFs (Figura 4). Las glicaciones son a su vez determinantes en la estabilización estructural de los PHFs, y por lo tanto en la patogénesis del Alzheimer. La glicación corresponde a la condensación de un grupo aldehido de un azúcar con grupos NH2 libres tales como e-amino de lisinas reactivas en la proteína, para formar una base de Schiff. El aducto resultante sufre rearreglos irreversibles para formar un producto que resulta de una modificación covalente (20). La estabilidad de los ovillos neurofibrilares y el alto contenido de lisina en tau, hacen que estas estructuras sean un blanco molecular para reacciones de glicación. Se investiga si la glicación es un evento posterior a las primeras etapas de agregación de tau. Sin embargo, se ha descrito que ocurrirían a través de un tiempo prolongado para hacer estas proteínas gradualmente más insolubles y promoviendo la agregación de los PHFs. Utilizando sondas inmunológicas sitio-dirigidas, junto con estudios de modificaciones en la estructura de tau, se ha podido analizar la naturaleza de las posibles alteraciones que llevan a tau a la formación de estos filamentos anómalos (20). En estudios in vitro, la tau purificada de tejido nervioso se autoagrega para formar fibras del tipo de los PHFs. Por ejemplo, la reacción de carbamilación en tau, que ocurre a nivel de lisinas altamente reactivas, llevan a su autoagregación formando polímeros resistentes como los encontrados en los PHFs.


Figura 4. Posible mecanismo en múltiples etapas para representar en forma esquemática la acción del estrés oxidativo sobre las modificaciones de tau durante la fase inicial de la enfermedad de Alzheimer. En eventos tempranos, el estrés oxidativo genera daño neuronal a través de la modificación de proteínas por el producto de la oxidación lipídica hidroxinonenal (HNE) como también por la desfosforilación de la proteína tau. Esta desfosforilación es producida por la activación de fosfatasas del tipo PP1, cuyo inhibidor es modificado por la proteína quinasa cdk5. Estos eventos tempranos darían curso a eventos iniciales de ologomerización de tau, concomitantemente con reacciones de hiperfosforilación de ésta por los sistema cdk5 y Gsk3ß (eventos tardíos) (32) una vez que los mecanismos neuroprotectores de la neurona dejen de actuar y se rompa el equilibrio entre la actividad de fosfatasas y proteínas quinasas en este sistema.

¿Qué papel juega el estrés oxidativo
en la degeneración neuronal?

Una serie de evidencias indican que el estrés oxidativo es uno de los factores determinantes en la neurodegeneración (45). El estrés oxidativo en las neuronas es producido por la generación de radicales libres a través de procesos oxidativos y por otro lado, por las especies reactivas provenientes del medio y de la dieta. La importancia del estrés oxidativo en el desarrollo de EA se ha evidenciado a través de estudios epidemiológicos que demuestran que sujetos con hemocromatosis hereditaria, una patología en la cual existe una alteración en el transporte y la homeostasis del hierro, muestran una tasa significativamente superior de EA en comparación con sujetos normales. El hierro es un metal de transición que experimenta reacciones redox y que puede acumularse en el cerebro durante la vida de un organismo, aumentando la vulnerabilidad neuronal al estrés oxidativo (45). En estudios de nuestro laboratorio, en que se expusieron células del hipocampo al estrés por peróxidos o por tratamiento con hierro oxidado, se logró determinar un marcado incremento en los niveles de radicales de oxígeno (ROS), asociado a la formación de aductos de proteínas neuronales con el aldehido 4-hidroxinonenal (HNE) producido por la peroxidación lipídica (46). Estudios de inmunolocalización con un anticuerpo anti-HNE demostraron que se modificaban proteínas de la membrana plasmática como del citoplasma neuronal y lo más interesante que la proteína tau era un sustrato preferencial en esta modificación. A diferencia de las alteraciones en los mecanismos de señalización producidos por Ab, los efectos del estrés oxidativo se manifiestan a través de un proceso en múltiples etapas. En una fase aguda, el daño oxidativo a la neurona induce mecanismos de respuesta que permiten activar fosfatasas específicas del tipo de la PP1 y PP2A, que conllevan a una desfosforilación de los epítopos del tipo Alzheimer en tau. Sin embargo, como resultado del efecto sostenido del estrés oxidativo en las neuronas, los mecanismos de neuroprotección de las neuronas no son suficientes para contrarrestar el efecto del estrés. Esto produce que el efecto de la sobreactivación de quinasas como cdk5/p35 modifique a la tau en los dominios reconocidos de las hiperfosforilaciones anómalas como las encontradas en la EA (ver Figura 4). Ello reflejaría lo que ocurriría en etapas más avanzadas de esta enfermedad.

Alteraciones en los mecanismos de señalización celular
en el contexto de la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer

Estudios realizados en nuestro laboratorio y por otros grupos indican que tanto el depósito de Ab, como el estrés oxidativo y los procesos inflamatorios alteran los patrones normales de señalización celular, a través de un conjunto de vías de transducción de señales. En el contexto de los factores proinflamatorios como las IL-1 y IL-6, hemos descrito que IL-6 induce la activación de la vía de las MAP kinasas (MAPK), en células del hipocampo. Se ha observado un marcado incremento de la forma fosforilada activa de ERK y del factor de transcripción p-STAT3, los cuales tendrían conexión con la vía de la cdk5/p35. Neuronas de hipocampo expuestas a IL-6 en el rango de concentración nanomolar incrementan dramáticamente los niveles de tau hiperfosforilada en los epitopos del tipo Alzheimer, lo que esta de acuerdo con el incremento en la expresión del activador p35 de la enzima cdk5 (47). La modificación en tau inducida por IL-6 es un evento dependiente del sistema cdk5/p35, lo que se corrobora porque el inhibidor de cdk5, butirolactona, bloquea el efecto de IL-6 sobre la hiperfosforilación en tau. La acción de IL-6 parece ser también dependiente del calcio citosólico. En el contexto de la complejidad del papel del calcio en la neurodegeneración, se ha descrito que Ab es capaz de desregular el receptor nicotínico a7, con la consecuente activación del sistema de la cdk5, un efecto que puede ser contrarrestado por moléculas agonistas del tipo de las citisinas (Muñoz et al., resultados no publicados). Otras vías que se verían afectadas por el daño derivado de la deposición del Ab sería la vía del receptor RAGE para productos altamente glicosilados (48), la cual puede activar mecanismos pro-apoptóticos y en consecuencia promover una sobreactivación del programa de muerte celular en condiciones patológicas. Un esquema representativo de algunas de estas vías se muestra en la Figura 5.


Figura 5. Esquema que representa diferentes vías de transducción de señales que se verían afectadas en los eventos tempranos que llevan a la hiperfosforilación de tau entre otros cambios intraneuronales durante el proceso neurodegenerativo, y en consecuencia a la disfunción y finalmente muerte neuronal. Se identifican los sistemas receptores (Receptor de IL-6, NMDA, receptor nicotínico a7 y RAGE) que según las evidencias acumuladas estarían mas directamente involucrados en la patogénesis de la Enfermedad de Alzheimer.

Proyecciones hacia posibles vías de
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer

A pesar de las numerosas investigaciones en el área biomédica, aún no existe un tratamiento efectivo para la cura de la EA. Los enfoques terapéuticos están orientados a obtener un cierto grado de mejoría del paciente en etapas iniciales de la enfermedad. Un cuidado médico apropiado puede reducir muchos de sus síntomas y permite apoyar al paciente y a su familia en relación a los múltiples problemas de esta enfermedad. Es por ello que la búsqueda de una terapia eficaz contra la EA dependerá del mayor conocimiento de sus mecanismos biológicos (8). Sin embargo, la neuropatología del Alzheimer es muy compleja. Los fármacos que podrían usarse en ensayos terapéuticos son de efectividad incierta para controlar su efecto en una forma más rigurosa posible (ver revisión Mayeux et al., ref. 49). En general, es importante realizar una evaluación clínica neuropsicológica sistemática del paciente, midiendo las posibles alteraciones cognitivas y analizar la posible acción de algunos fármacos en uso, con un alto grado de atención a los posibles efectos colaterales que éstos puedan generar. En este contexto, y sobre la base de los aspectos delineados en este estudio, un blanco para el diseño de nuevos fármacos es el control de los efectos del hierro y el estrés oxidativo así como de los procesos inflamatorios. Esto se logra asociando antioxidantes en combinación con compuestos con actividad anti-inflamatoria que contrarresten los procesos que llevan a la liberación de factores como IL-1 y IL-6. En este contexto la posible terapia inmunológica ofrece una vía importante para la EA. La formación de los depósitos de Ab, así como la de los PHFs, son blancos potenciales para diseñar aproximaciones terapéuticas contra el Alzheimer y ello dependerá del conocimiento que se tenga sobre los mecanismos moleculares de la generación de estas estructuras (5). Derivado de nuestras investigaciones, una nueva vía hacia la exploración de una herramienta terapéutica se abre con el diseño de posibles inhibidores que interfieran de manera regulada en la interacción entre cdk5 y los activadores p35 o p25. De este modo se podría controlar las hiperfosforilaciones en tau, un aspecto que se está desarrollando en nuestro laboratorio a través de programas de modelamiento molecular y sistemas de simulación de potenciales drogas junto con estudios experimentales a nivel molecular. El artículo de Cassels que se presenta en esta serie aborda también algunos de los aspectos de la terapia farmacológica. Por otra parte, el conocimiento que se tenga de los genes de apoe y de la naturaleza de esta lipoproteína podría ayudar a identificar factores de riesgo controlables para la EA. Se propone también como vía de investigación terapéutica el bloqueo de las b y g-secretasas que cortan en forma anómala a la proteína APP y que conducen a la formación de las placas. En general, las vías que permitan controlar los procesos bioquímicos alterados en el Alzheimer podrían abrir las puertas hacia posibles enfoques farmacológicos para el tratamiento de esta enfermedad.

Agradecimientos

A todos los investigadores de nuestro Laboratorio de Biología Celular y Molecular y estudiantes de Doctorado por los valiosos aportes e interminables discusiones en torno a esta investigación, la que ha sido financiada en parte por la Iniciativa Científica Milenio proyecto P99-031F y proyecto Fondecyt 1020155 (a RBM).

Uno de los más grandes desafíos para la medicina moderna lo constituye la enfermedad de Alzheimer, desorden neuropsiquiátrico sobre cuyo conocimiento se ha avanzado de manera vertiginosa en las últimas dos décadas. Estos avances se fundamentan en el desarrollo de lo que hoy conocemos como la moderna medicina molecular. Dicha enfermedad se caracteriza principalmente por la formación de dos tipos de agregados proteicos: (i) los ovillos neurofibrilares, formados por la asociación de filamentos pareados helicoidales, los cuales a su vez derivan de la autoasociación de la proteína tau y (ii) los depósitos de ß-amiloide (Aß) que forman las placas seniles. Las evidencias acumuladas en los últimos años destacan el papel de las hiperfosforilaciones de la proteína tau a nivel intraneuronal como un evento central en la patogénesis de la neurodegeneración en el Alzheimer. Investigaciones recientes en nuestro laboratorio llevaron a descubrir que una desregulación en el sistema de la proteína quinasa cdk5/p35 es determinante para la hiperfosforilación en tau. Esto último ha conducido a una serie de investigaciones para dilucidar las alteraciones que ocurren en la cascada de señalización que conducen a esta pérdida de regulación en el sistema de la cdk5, involucrando al parecer a otras quinasas tales como la Gsk3ß. En este contexto, se ha observado que además de los depósitos de Aß, el estrés oxidativo y los procesos inflamatorios promueven cambios, a veces irreversibles, en los mecanismos normales de señalización, los que generarían una disfunción de las neuronas cerebrales, especialmente en áreas del hipocampo, y llevarían a la muerte neuronal en etapas avanzadas de la enfermedad. En este estudio, se analiza la relación entre los factores extraneuronales que determinan la desregulación en el sistema de proteínas quinasas y las modificaciones de la proteína tau, un paradigma central en esta patología.

Palabras clave: enfermedad de Alzheimer, patogenia

Referencias

1. Graever MB, Kosel S, Egensperger R, Banati RB, Muller U, Bise K, et al. Rediscovery of the case described by Alois Alzheimer in 1911: historical, histological and molecular genetic analysis. Neurogenesis 1997; 1-73         [ Links ]

2. Gomez-Isla T, Hollister R, West H, et al. Neuronal loss correlates with but exceeds neurofibrillary tangles in Alzheimer‘s disease. Ann Neurol 1997; 41: 17-24         [ Links ]

3. Cotman CW, Whittemore ER, Watt JA, Anderson AJ, Loo DT. Possible role of apoptosis in Alzheimer’s disease. Ann New York Acad Sci 1994; 747: 36-49         [ Links ]

4. West MJ. Differences in the pattern of hippocampal neuron loss in normal aging and Alzheimer’s disease. Lancet 1994; 344: 769-772        [ Links ]

5. Maccioni RB, Muñoz JP, Barbeito L. The molecular bases of Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Arch Med Res 2001a; 32:367-381        [ Links ]

6. Maccioni RB, Rodrigues P. Alzheimer disease: an attack of protein aggregates to human brain. Ciencia Hoje 1995; 20: 34-40        [ Links ]

7. Maccioni RB, Cambiazo V. Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly. Pysiol Revs 1995; 23: 1-27        [ Links ]

8. Selkoe D. Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer’s disease. Nature 1999; 399: A23-A31        [ Links ]

9. Selkoe D. Alzheimer’s disease: genes, proteins and therapy. Physiol Reviews 2001; 81: 741-766        [ Links ]

10. Gandy S, Petanceska S. Regulation of Alzheimer b amyloid precursor trafficking and metabolism. Bioch Biophy Acta 2000; 1502: 44-52        [ Links ]

11. Goate A, Chartier-Harlin MC, Mullan M. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer’s disease. Nature 1991; 349: 704-707        [ Links ]

12. Hyman BT, Marzloff K, Arriagada PV. The lack of accumulation of senile plaques or amyloid burden in Alzheimer’s disease suggests a dynamic balance between amyloid deposition and resolution. J Neuropath Exp Neurol 1993; 52: 594-600        [ Links ]

13. Selkoe DJ. Cell biology of the amyloid b-protein precursor and the mechanism of Alzheimer’s disease. Ann Rev Cell Biol 1994; 10: 373-403        [ Links ]

14. Mullan M, Crawford F. Axelman K, et al. A pathogenic mutation for probable Alzheimer’s disease in the APP gene at the N-terminus of beta-amyloid. Nature Genetics 1992;1: 345-347        [ Links ]

15. Rosenberg RN. Explaining the causes of the amyloid burden in Alzheimer disease. Arch Neurol 2002; 59: 1367-1368        [ Links ]

16. Cummings JL, Diaz C, Levy M, Binetti G, Litvan, II. Neuropsychiatric Syndromes in neurodegenerative Disease: Frequency and significance. Semin Clin Neuropysychiatry 1996; 1: 241-247        [ Links ]

17. Spillantini MG and Goedert M Tau protein pathology in neurodegenerative diseases. Trends Neurosci 1998; 21: 428-433        [ Links ]

18. Takashima A, Noguchi K, Sato K, Hoshino T, Imahori K. Tau protein kinase I is essential for amyloid beta-protein-induced neurotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 7789-7793        [ Links ]

19. Maccioni RB, Otth C, Concha II, Muñoz JP. The protein kinase cdk5: structural aspects, roles in the neurogenesis and involvement in Alzheimer´s pathology. European J Biochemistry 2001b; 268: 1518-1527        [ Links ]

20. González-Billault C, Farías G, Maccioni RB. Modification of tau to an Alzheimer´s protein interferes with interaction with microtubules. Cell Mol Biol 1998; 44: 1117-1127        [ Links ]

21. Álvarez A, Toro R, Cáceres A, Maccioni RB. Inhibition of tau phosphorylating protein kinase cdk5 prevents beta-amyloid induced neuronal death. FEBS Lett 1999a; 459: 421-426        [ Links ]

22. Álvarez A, Toro R, Muñoz JP, Maccioni RB. Inhibition of tau phosphorylating protein kinase cdk5 prevents Ab-induced neuronal death in Alzheimer´s neuronal models. Molecular Biology of the Cell. 1999b; 10: p.61        [ Links ]

23. Álvarez A, Muñoz JP, Maccioni RB. Participation of a cdk5/p35 complex in the beta amyloid induced deregulation of cdk5 activity in hippocampal cells. Exper Cell Res 2001; 264: 266-274        [ Links ]

24. Mandelkow EM, Biernat J, Drewes G, Gustke N, Trinczek B, Mandelkow E. Tau domains, phosphorylation, and interactions with microtubules.Neurobiol Aging 1995; 16: 355-363        [ Links ]

25. Saragoni L, Hernandez P, Maccioni RB. Differential association of tau with subsets of microtubules containing posttranslationally-modified tubulin variants in neuroblastoma cells. Neurochem Res 2000; 25: 59-70        [ Links ]

26. Cross DC, Munoz JP, Hernandez P, Maccioni RB. Nuclear and cytoplasmatic tau proteins from human nonneuronal cells share common structural and functional features with brain tau. J Cell Biochem 1993; 78: 305-317        [ Links ]

27. Wischik CM, Novak M, Thogersen HC, Edwards PC, Runschwik MJ, Jakes R, et al. Isolation of a fragment of tau derived from the core of the paired helical filament of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 4506-4510        [ Links ]

28. Schweers O, Mandelkow EM, Biernat J, Mandelkow E. Oxidation of cysteine-322 in the repeat domain of microtubule-associated protein tau controls the in vitro assembly of paired helical filaments. Proc. Natl Acad Sci USA 1995; 92: 8463-8467        [ Links ]

29. Kampers T, Friedhoff P, Biernat J, Mandelkow EM, Mandelkow E. RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Lett 1996; 399: 344-349        [ Links ]

30. King ME, Gamblin TC, Kuret J, Binder LI. Differential assembly of human tau isoforms in the presence of arachidonic acid. J Neurochem 2000; 74: 1749-1757        [ Links ]

31. Von Bergen M, Barghorn S, Li L, Marx A, Biernat J, Mandelkow EM, et al. Mutations of tau protein in frontotemporal dementia promote aggregation of paired helical filaments by enhancing local b-strucure. J Biol Chem 2001; 276:48165-48174        [ Links ]

32. Michel G, Mercken M, Murayama M, Nogushi K, Ishiguro K, Imahori K, et al. Characterization of tau phosphorylation in GSK3b and cyclin dependent kinase-5 activator transfected cells. Biochim Biophys Acta 1998; 1380: 177-182        [ Links ]

33. Chin JY, Knowles RB, Schneider A, Drewes G, Mandelkow EM, Hyman BT. Microtubule-affinity regulating kinase (MARK) is tightly associated with neurofibrillary tangles in Alzheimer brain a fluorescence resonance energy transfer study. J. Neuropath Exp Neurol 2000; 59: 966-971        [ Links ]

34. Lee MS, Kwon YT, Li M, Peng J, Friedlander RM, Tsai L. Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain. Nature 2000; 405: 360-364        [ Links ]

35. Godemann R, Biernat J, Mandelkow E, Mandelkow EM. Phosphorylation of tau protein by recombinant GSK-3beta: pronounced phosphorylation at select Ser/Thr-Pro motifs but no phosphorylation at Ser 262 in the repeat domain. FEBS Lett 1999; 2:157-164        [ Links ]

36. Glenner GG, Wong CW. Alzheimers´s disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun 1984; 16: 885-890        [ Links ]

37. Pike C, Overman MJ, Cotman CW. Amino-terminal deletions enhance aggregation of b-amyloid peptide in vitro. J. Biol. Chem. 1995; 270: 23895-23898        [ Links ]

38. Gomez-Isla T, West HL, Rebeck GW, et al. Clinical and pathological correlates of apolipoprotein E e4 in Alzheimer’s disease. Ann Neurol 1996; 39: 62-70        [ Links ]

39. Kang DE, Saitoh T, Chen X, Xia Y, Masliah E, Hansen LA, et al. Genetic association of the low-density lipoprotein receptor-related protein gene (LRP), an apolipoprotein E receptor, with late-onset Alzheimer´s disease. J Med Genet 1997; 49: 56-63        [ Links ]

40. Busciglio J, Lorenzo A, Yeh J, Yanker BA. Beta-amyloid fibrils induces tau phosphorylation and loss of microtubule binding. Neuron 1995; 14: 879-888        [ Links ]

41. Dhavan R, Tsai LH. A decade of CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 749-759        [ Links ]

42. Otth C, Concha II, Arendt T, Stieler J, Schliebs R, Gonzàlez-Billault Ch, Maccioni RB. AbPP induces cdk5-dependent tau hyperphosphorylation in transgenic mice Tg2576. J Alzheimer´s Disease. 2001; 3: 1-14        [ Links ]

43. Patrick GN, Zuckerberg L, Nikolic M, De la Monte S, Dikkes P, Tsai LH. Conversion of p35 to p25 deregulates cdk5 activity and promotes neurodegeneration. Nature 1999; 402: 605-622        [ Links ]

44. Ahlijanian M, Barrezueta N, Williams R, Jakowski A, Kowsz K, McCarthy S, Coskran T, Carlo A, Seymour P, Burkhardt J, Nelson R, McNeish J. Hyperphosphorylated tau, neurofilaments and cytoskeletal disruptions in mice overexpressing human p25, an activator of cdk5. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 2910-2915        [ Links ]

45. Smith M, Harris P, Sayre L, Perry G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 9866         [ Links ]

46. Egaña JT, Zambrano C, Nuñez, MT, González-Billault C, Maccioni RB. Iron-induced oxidative stress modify Tau phosphorylation patterns in hippocampal cell cultures. BioMetals 2003; 16: 215-223        [ Links ]

47. Quintanilla R, Orellana D, Gonzalez-Billault C, Maccioni RB. Interleukin-6 induces Alzheimer´s type phosphorylation of tau protein by the Cdk5/p35 pathway. Mol Biol Cell 2002; (in press)         [ Links ]

48. Yan SD, Chen X, Fu J, Chen M, Zhu H, Roher A, et al. RAGE and amyloid Ab neurotoxicity in Alzheimer´s disease. Nature 1996; 382: 685-689        [ Links ]

49. Mayeux R y Sano M. Treatment of Alzheimer´s disease. N. Engl J Med 1999; 34: 1670-1684        [ Links ]

Dirección para la correspondencia:
Prof. Dr. Ricardo B. Maccioni
Instituto Milenio de Estudios Avanzados CBB
Facultad de Ciencias, Edificio Milenio, Las Encinas 3370, Ñuñoa, Santiago
Fax: (562) 276 4014
Email: cbb@uchile.cl


Instituto Milenio de Estudios Avanzados en Biología Celular y Biotecnología (CBB), Universidad de Chile.

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