SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.21 issue2INNERVATION OF THE SEMITENDINOUS MUSCLE, BIOMETRY OF THE BRANCHES AND LOCATION OF ITS MOTOR POINTS author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Journal

Article

Indicators

Related links

Share


International Journal of Morphology

On-line version ISSN 0717-9502

Int. J. Morphol. vol.21 no.2 Temuco  2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-95022003000200012 

II REUNIÓN ANUAL SOCIEDAD DE ANDROLOGÍA
Y GAMETOLOGÍA DE CHILE

IV JORNADAS INTERNACIONALES
DE MEDICINA REPRODUCTIVA
Y BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN

DEDICADAS AL
PROFESOR DR. EDUARDO BUSTOS OBREGÓN,
EN SUS 65 CUMPLEAÑOS

9 - 10 de Enero de 2003

Universidad de La Frontera

TEMUCO - CHILE

AUSPICIADORES

FONDECYT 1010729/7010729-2001
W. REICHMANN
ORGANON
ANDES IMPORT
RECALCINE S.A.
PFIZER DE CHILE
CIENTEC
SILESIA
GRÜNENTHAL CHILENA LTDA.
CLÍNICA ALEMANA DE TEMUCO
ARQUIMED
SCHERING DE CHILE

PATROCINANTES

SERVICIO DE SALUD ARAUCANIA SUR
SERVICIO DE SALUD ARAUCANIA NORTE
DPTO. CIENCIAS BÁSICAS
DPTO. CIENCIAS PRECLÍNICAS
DPTO. MEDICINA INTERNA
DPTO. DE OBSTETRICIA Y GINECOLOGÍA
FACULTAD DE MEDICINA
DIRECCIÓN DE EXTENSIÓN
UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA
SOCIEDAD CHILENA DE REPRODUCCIÓN Y DESARROLLO

EL EMBRIÓN DE POLLO COMO MODELO PARA EL ESTUDIO DE EMBRIOLOGÍA EXPERIMENTAL: IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS GERMINALES PRIMORDIALES (CGP) (Chicken embryo as model for experimental embryology study: identification of primordial germ cells). Acosta, A.; Acuña, P.; Alam, V.; Aranda, P.; Betancourt,V.; Varas, M.A.; Rojas, M. & Araya, M. Laboratorio de Embriología Comparada, Programa de Morfología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

El pollo es un animal que tradicionalmente ha sido utilizado en los estudios de biología del desarrollo, debido a su fácil manejo, rápido desarrollo y embriogénesis temprana similar a la de los humanos. El objetivo de este estudio es la caracterización y ubicación cronológica de las CGP del embrión de pollo, como un aporte, para los trabajos que utilizan este sistema para testar el efecto de diversos pesticidas o medicamentos, sobre la función reproductiva.

Se utilizaron tres grupos de 20 embriones con 24, 48 y 72 horas de incubación respectivamente, los cuales fueron procesados según la técnica de Zwilling (1959) y dos técnicas de tinción: Eosina y BCIP/NBT (Dako), esta última reconoce las células que contienen la enzima fosfatasa alcalina (CGP).

Las CGP se ubican en los primeros estadios de desarrollo (24 horas) en el polo caudal del epiblasto. Posteriormente, entre 24 y 48 horas, migran a lo largo del mesenterio dorsal del intestino caudal, hacia el mesénquima y epitelio próximos al mesonefros, A las 72 horas colonizan los esbozos pregonádicos derecho e izquierdo.

Este estudio, que fue realizado utilizando técnicas de tinción "in toto" permite conocer la cronología migratoria de las células germinales primordiales embrionarias. Es preciso destacar que la colonización se evidenció en ambos esbozos pregonádicos, lo cuál es de gran interés si se considera que el pollo tiene solo una gónada funcional y la otra es vestigial.


EFECTOS DEL PARATHION COMERCIAL SOBRE ESPERMATOZOIDES DE RATÓN OBTENIDOS DE CAUDA EPIDIDIMARIA
(Effects of commercial parathion on mouse sperm from cauda of epidydymus). Castro, C.; Czwiklitzer, G.; Sarabia Villar, L. & Bustos Obregón, E. Laboratorio de Biología de la Reproducción, Programa de Morfología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

El Parathion es un insecticida organofosforado de alta efectividad, ampliamente usado en el campo agrícola, actúa a distintos niveles pulmón, hígado y cerebro, ya que en estos órganos es rápidamente biotransformado en el metabolito activo más potente como es el Paraoxon. El objetivo de este trabajo es estudiar las posibles alteraciones producidas por este compuesto a nivel del material genético en células de la línea germinal de ratones machos de la cepa CF (10 a 12 semanas de edad) con un peso promedio de 37 +/- 2 gr., mantenidos bajo un fotoperíodo de 12/12 horas, pellet comercial y agua ad libitum. Para lograr el objetivo se aspersaron solo una vez 16 ratones con Parathion comercial 20% en una caja de vidrio hermética con una dosis de 1500 mg. /m3 y luego fueron separados en cuatro grupos. Paralelamente se formaron cuatro grupos (dos individuos) aspersados solo con agua destilada (control). Los animales fueron sacrificados a los días 1, 8, 22 y 43. Se evaluaron dos parámetros 1. Condensación de la cromatina (técnica del tioglicolato de sodio) y 2. Estabilización del ADN mediante la tinción de anaranjado de acridina que muestra si el ADN esta en cadena simple (monocatenario; fluorescencia roja metacromática) bajo microscopia de fluorescencia o es bicatenario (fluorescencia verde ortocromática). Los resultados con el test de Tioglicolato de sodio muestran un aumento de la descondensación de la cromatina en todos los días pos tratamiento estudiados (1,8,22 y 43) con respecto al control (p < 0.01) y una mayor labilidad de la hebra de ADN ampliamente marcada al día siguiente del tratamiento para recuperarse en el día 8 y luego nuevamente subir en el día 22 y 43. (p < 0.01).

Estos resultados muestran que el daño es inmediato a nivel de espermatozoides maduros (día 1) sugiriendo que el parathion afecta a los espermatozoides que ya se encuentran en el epidídimo y se mantiene en los tiempos estudiados sugiriendo que también afecta incluso a las espermatogonias (día 43).


ESTUDIO DE TINCIONES APLICADAS AL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DEL TEJIDO TESTICULAR
(Stains analysis applied to hysthopatological diagnosis of testicular tissue) Dalbosco, D.; Espinoza, C.; Game, D.; Osorio, F.; Pereira, N.; Valenzuela, F.; Sarabia Villar, L. & Bustos Obregón, E. Laboratorio de Biología de la Reproducción, Programa de Morfología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

En la actualidad existen innumerables métodos para el diagnóstico histopatológico del testículo, incluidos estudios histoquímicos e inmunohistológicos. Sin embargo, siempre es necesario contar con al menos una tinción corriente para evaluar el tejido testicular. La mayoría de los laboratorios usa la tinción de Hematoxilina y Eosina. Ella entrega información de las características generales de la célula. y características del tipo de secreción. Además es de fácil implementación , estandarización y de bajo costo. El objetivo de este trabajo es analizar diversas tinciones para determinar cuál o cuales de ellas son recomendables para un diagnóstico testicular inicial y poder dirigir un posterior estudio inmunológico. Se trabajó con muestras de tejido testicular provenientes de individuos mayores de 60 años, operados por castración bilateral por cáncer prostático y sin tratamiento hormonal previo en el Hospital San José de Santiago, Las muestras fueron fijadas en Bouin acuoso durante 8 horas y en paralelo tambíen se fijaron muestras en formalina tamponada 10% pH 7.2 Luego se siguió con la técnica histológica corriente hasta obtener cortes de 5 um. Las tinciones fueron, Hematoxilina-Eosina, Safranina-Toluidina, Tricrómico de Arteta o la reacción del ácido Peryódico de Schiff - Hematoxilina (PAS- H). Las observaciones indican que con la tinción de Hematoxilina y Eosina se detallan muy bien las agrupaciones celulares y características citológicas. Además, se alcanzan a diferenciar características tales como fibrosis e hialinización. La tinción de Safranina -Toluidina no mostró un buen contraste entre el citoplasma y el núcleo y solo se tiñeron los núcleos más condensados correspondientes a estados más avanzados de la espermatogénesis. La tinción tricrómica de Arteta presentó características similares a la H-E con el agregado que al tener azul de anilina se logra observar con bastante claridad el colágeno presente en el tejido. La técnica de PAS-H muestra buen contraste nuclear y por sus características es capaz de teñir el acrosoma de las espermátidas en evolución. En conclusión, las técnicas recomendadas para el diagnóstico inicial de la histopatología testicular son la tinción de Arteta, que facilita el diagnostico de patologias como la fibrosis intersticial, hialinización, cicatriz y otras propias del colágeno y la técnica de PAS-H, para observar el desarrollo que alcanzan las células germinales del paciente.


INFLUENCIA DE MALATHION®, EN EL SISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO DE LOMBRIZ DE TIERRA, Eisenia foetida. UNA ESPECIE BIOCENTI-NELA(Influence of malathion on the male reproductive system of Eisenia foetida) 1Espinoza, O.; 2Bustos-Obregón, E. 1Universidad de Tarapacá, Facultad de Ciencias, Depto. Biología y Salud. 2Universidad de Chile, Facultad de Medicina, Laboratorio Biología de la Reproducción.

Malathion, es un insecticida organofosforado de amplio uso en control de plagas en la agricultura, en casa y jardín. Su efecto tóxico, se debe a que actúa como inhibidor de la colinesterasa. Pese a su efectividad, malathion, tiene el potencial de producir daños morfológicos y genéticos. (Sobarzo, Bustos-Obregón, 2000 y Espinoza, Bustos-Obregón, 2002).

Eisenia foetida, gusano segmentado (Annelida, Oligochaeta), resulta ser un excelente modelo de organismo biocentinela, para evaluar los riesgos tóxicos de xenobióticos, en ecosistemas terrestres. (Cikutovic, 1991 y Paoletti, 1999).

El presente estudio evalúa el daño tóxico de malathion, midiendo las alteraciones morfológicas externas y del reproductor masculino de E. foetida, sometidos a dosis únicas subletales del insecticida y observadas a los 5, 15 y 30 días postratamiento. Se tomaron muestras para histología y recuento espermático usando la técnica de d-Bromo Uridina, tioglicolato de sodio (0,8M) y Naranja de Acridina,

Los resultados observados en animales tratados, indican un incremento significativo del número de espermatozoides, a los 5 días, seguida de una disminución entre los 15 y los 30 días. De igual forma se observa un aumento de metacromasia con Naranja de acridina. El uso de d-BromoUridina, demuestra, que el epitelio de espermateca, se encuentra en máxima proliferación. (30 días p.t.) Externamente, se observa diversos grados de contracción corporal, siendo el más característico el enrrollamiento de la cola.

Se concluye que E. foetida, especie biocentinela, permite detectar que, malathion es un compuesto genotóxico, que altera el funcionamiento del reproductor masculino, afectando el ciclo celular y provocando quiebres en el ADN de sus espermatozoides.

Financiamiento parcial Banco Santander Central Hispano, Madrid


EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO SOBRE EL TEJIDO TESTICULAR EN EL ROEDOR Octodon degus. (Effects of aging on testicular tissue in octodon degus). 1Castro, G.; Sarabia, L.; Bustos-Obregón, E. & 2Esponda, P. Laboratorio de Biología de la Reproducción, Programa de Morfología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. 1Fac. Medicina Veterinaria, UNICIT, 2CSIC, Madrid, España.

La senescencia es un proceso continuo, genéticamente controlado y modificado por numerosos factores medioambientales. Afecta el remodelado que los tejidos normalmente sufren, La producción disminuida de semen en animales seniles puede ser un reflejo del sistema de renovación alterado del epitelio seminífero. Puede postularse que la producción de células está disminuida o la pérdida de células estaría aumentada o ambas. En el presente estudio se caracterizó morfometricamente el testículo de Octodon degus de 3 edades distintas(joven, adulto y senil), mediante la determinación del diámetro y altura del epitelio tubular seminífero y la relación porcentual intersticio-túbulo.

Los testículos fueron fijados en Bouin alcohólico para microscopia de luz y teñidos con hematoxilina-PAS. Posteriormente se dibujaron los cortes con una cámara lucida. Los dibujos se digitalizaron y con el programa Scion Images se realizaron las mediciones morfométricas. Los resultados mostraron variación en el diámetro tubular entre los grupos de roedores jóvenes v/s seniles y adultos v/s seniles (p< 0.0001). Sin embargo no existió variación significativa entre roedores jóvenes v/s adultos (p>0.08). Respecto de altura del epitelio se observó variación entre los grupos de roedores jóvenes v/s seniles y adultos v/s seniles (p<0.0001). Sin embargo entre los grupos joven v/s adulto no se observó cambios significativos en la altura epitelial. En la relación porcentual intersticio-túbulo existió variación entre los tres grupos etarios.

Los cambios que ocurren con el envejecimiento podrían deberse a la producción durante la esteroidogénesis de una alta concentración de peróxidos en las células de Leydig. Los radicales de oxigeno provocarían cambios acumulativos y mutaciones en el ADN, con el consiguiente cambio en la expresión de genes, apoptosis y perdida en la comunicación y diferenciación entre la línea germinal y sertoliana. De esta forma se vería afectada tanto cualitativa como cuantitativamente la producción espermatogénica y la composición del epitelio seminífero.

Financiamiento parcial Banco Santander Central Hispano, Madrid


EFECTO DEL MALATHION® EN LA MIGRACIÓN Y COLONIZACIÓN DE CÉLULAS GERMINALES DE POLLO

(Effects of malathion on migration and colonizing of chicken germ cells). 1Goelkel, A.; Rojas, M., Bustos-Obregón, E.1Universidad del Norte, Barranquilla, Colombia y Programa de Morfología, Facultad de Medicina Universidad de Chile

El Malathion® es un agropesticida organofosforado ampliamente utilizado en la agricultura. El presente estudio tiene como propósito determinar el efecto del Malathion® en la migración y colonización de células germinales primordiales embrionarias de pollo.

Se utilizó 60 huevos embrionados, los cuales fueron divididos en cuatro grupos de 15; uno control y los otros tres tratados con dosis de 40, 20 y 10 mg de Malathion®, por períodos de 48, 72 y 96 horas de incubación a 37°C. El pesticida se aplicó por instilación según procedimiento de Zwilling (1959). Un subgrupo se fijó en metanol-acetona y tinción "in toto" con BCIP-NBT (anticuerpo antifosfatasa alcalina). El otro subgrupo se procesó para técnicas histológicas corriente, Masson, PAS.

En los grupos tratados con 40 mg de Malathion®, no hubo desarrollo embrionario, pero sí del sistema circulatorio extraembrionario. Los grupos tratados con 20 mg, presentaron un desarrollo de vasos sanguíneos más evidente, pero algunos murieron y otros presentaron malformaciones congénitas. El grupo tratado con 10 mg presentó un retraso en el crecimiento y leves defectos congénitos,

En el grupo control, se observó las células germinales primordiales, en fase de migración, A las 72 horas habían iniciando la colonización de la gónada y a las 96 horas una evidente proliferación. En los grupos tratados se identificó principalmente células germinales en degeneración y alteraciones en la proliferación y migración.

El Malathion® provoca trastornos de migración y formación de gónada y malformaciones congénitas en otros órganos y sistemas.

1Becario PLACIRH


PROLIFERACIÓN CELULAR EN EL TESTÍCULO LUEGO DE UNA DOSIS ÚNICA DE MALATIÓN (Cells proliferation in testes after one single dosis of malathion). González-Hormazábal, P. & Bustos-Obregón, E. Laboratorio de Biología de la Reproducción, Programa de Morfología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.

Los insecticidas del tipo organofosforado son de uso frecuente en nuestro país, fundamentalmente en la agricultura. Su principal efecto tóxico agudo se debe a la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa. Sin embargo, poco se ha estudiado respecto a sus efectos crónicos entre los cuales se encuentran los efectos sobre la reproducción. En el presente estudio se asociará un aumento de la proliferación del epitelio seminífero con una depleción tubular. Para ello se evaluará diámetro tubular, altura y área del epitelio seminífero en testículo de ratones adultos de la cepa CF1 tratados con 240 mg/kpc (1/12 DL50) de malatión 96% p/p a los días 1, 8, 16, 35 y 40 post tratamiento. Para los mismos grupos de tratamiento se evalúa la incorporación de timidina tritiada al testículo en el túbulo seminífero administrando una hora previo al sacrificio 2,5 uCi/gramo de peso corporal intraperitoneal. Complementariamente, se evaluó el potencial genotóxico mediante el test de micronúcleo para la misma dosis. Se observó una disminución significativa (p<0.01, test de Mann-Withney) de los parámetros histométricos evaluados en el día 8, con tendencia a la recuperación al día 40. La incorporación de la timidina aumenta solo en el día 16. El test de micronúcleo indica que malatión es genotóxico en esta dosis (4:1 respecto al grupo control; p<0,05, test de Mann-Withney). Malatión produce depleción del epitelio seminífero en el día 8, asociada a su potencial genotóxico, y gatilla una respuesta de repoblación de la línea germinal en el día 16, consistente con lo observado en testículo, luego de un tratamiento con agentes alquilantes del DNA. Esta repoblación de espermatogonias logra recuperar los parámetros histopatológicos luego de alrededor de tres ciclos del epitelio seminífero. En conclusión, malatión en bajas dosis es genotóxico tanto para células germinales como somáticas.

Financiamiento parcial Banco Santander Central Hispano, Madrid.


DESARROLLO DE EMBRIONES PREIMPLANTA-CIONALES DE RATÓN OBTENIDOS POR APAREAMIENTO DE MACHOS QUE INGIRIERON Erythrina falcata Benth (Fabaceae)
(Development of pre implantational mouse embryos from mating of male after falcata Berith ingestión). Gutiérrez-Pajares, J. L. Lab. de Reproducción y Biología del Desarrollo. U. Nacional Mayor de San Marcos, Perú.

El desarrollo embrionario temprano está regulado por los genomas paterno y materno, cambios en alguno de ellos por agentes ambientales puede conducir a cambios en la progresión y coordinación del desarrollo embrionario.

Se usaron 30 machos de fertilidad probada para administrarles 5 dosis consecutivas diarias de E. falcata al 35% (Ef35), 25% (Ef25) ó 0% (control) (w/v) vía oral. Se aparearon los machos con hembras vírgenes no tratadas entre los días 2-7 (P1), 9-22 (P2), 26-31 (P3) y 40-46 (P4) post tratamiento para evaluar las células germinales masculinas que durante el tratamiento fueron espermatozoides, espermátides, espermatocitos y espermatogonias, respectivamente.Después de 86 horas post cópula se colectaron los embriones para evaluar la morfología embrionaria, número de células por embrión e índice mitótico.

Se encontró una disminución en la proporción de blastocistos normales después del tratamiento paterno con E. falcata: 71% (P1), 53% (P2), 60% (P3) y 85% (P4) para el grupo Ef25; y 64% (P1), 50% (P2), 55% (P3) y 74% (P4) para el grupo Ef35, mientras que los controles mostraron 89% (P1), 92% (P2), 90% (P3) y 93% (P4). La proporción de embriones de morfología anormal fue mayor en los períodos 1, 2 y 3 (P<0.05). El número de células por embrión y el índice mitótico se encontraron disminuidos en ambos grupos tratados con E. falcata en los 4 periodos estudiados (P<0.05).

Este ensayo evidencia que la ingesta paterna de E. falcata afecta el desarrollo embrionario antes de la implantación en el ratón.


LOCALIZACIÓN EXTRACELULAR DEL PROTEASOMA EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS (Extracellular localization of proteasome in human sperm). Morales, P.; Pizarro, E.; Kong, M.; Pasten, C. & Jara, M. Universidad de Antofagasta, Antofagasta, Chile.

El proteasoma, un complejo proteásico multienzimático y que posee actividad hidrolásica tipo tripsina, quimotripsina y peptidilglutamilpeptidasa, esta presente en espermatozoides humanos (Tipler y cols., Mol Hum Reprod 3:1053, 1997). En este trabajo hemos estudiado la posibilidad que el proteasome tenga una localización extracelular, en la superficie de la membrana plasmática del espermatozoide. Espermatozoides móviles (>90%), obtenidos a través de una gradiente de percoll, fueron resuspendidos en PBS (25x106 células/ml) e incubados por 15 min a 37 C con 10 µM del inhibidor de proteasome clasto-lactacistina b-lactona (clasto) o 0.1% DMSO (control). Luego, el sustrato Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (SLLVY-AMC) fue agregado y la actividad enzimática evaluada en un espectrofluorómetro. Otras alicuotas espermáticas fueron resuspendidas en medio Tyrode e incubadas a 10x106, 30 x106, 50 x106 y 100x106 células/ml por 0, 5 y 20 hr con o sin clasto-lactacystin en la presencia de 0.4% azocaseina. La hidrólisis de azocaseina fue evaluada a 440 nm. Se obtuvieron proteínas de la membrana del espermatozoide suspendiendo las células en 0.1% tritón X-114, agitando vigorosamente por 1 hr, y dejando decantar por 4 hr para separar una fase acuosa y una de detergente, o resuspendiendo en 1% tritón X-100 por 4 hr y removiendo el material soluble por centrifugación a 5000 g por 40 min. La actividad proteásomica fue evaluada incubando las diferentes fracciones con SLLVY-AMC y su presencia corroborada por western blotting. Finalmente, espermatozoides no permeabilizados, fijados en 2% paraformaldehido fueron incubados con anticuerpos monoclonales anti proteasomas y evaluados usando inmunofluorescencia indirecta. Los resultados indican que: a) espermatozoides intactos fueron capaces de hidrolizar los substratos de proteasomes SLLVY-AMC y azocaseina. Esta actividad fue inhibida por clasto; b) proteína solubles de membrana del espermatozoide poseen actividad proteasómica, inhibida por clasto. Además, la presencia de proteasomes en estas fracciones fue corroborada por western blots; y c) la inmunofluorescencia reveló tinción en la cabeza del espermatozoide, particularmente en la región postacrosomal.

Financiado por FONDECYT 1011051


EFECTOS DEL MALATIÓN EN DOSIS ÚNICA (1/12 DL50) SOBRE LA HISTOLOGÍA TESTICULAR DEL RATÓN
(Effects of Malathion in a single dosis (1/12 Dl 50) on mouse testicular histology). Mosella, F.; Sosa, O.; Saavedra, M. & Rodríguez, H. Laboratorio de Histoembriología, Programa de Morfología. ICBM. Facultad Medicina. U de Chile.

Los pesticidas organofosforados tipo Malathion, combaten plagas domésticas y de cultivos. En mamíferos el Malathionâ y sus metabolitos malaoxón e isomalathion, se degradan a través de enzimas tipo carboxilesterasa. Este insecticida actúa como inhibidor de la acetilcolinesterasa e induce daños en el DNA. A nivel del epitelio seminífero causaría alteraciones en las diferentes poblaciones celulares alterando la espermatogénesis.

En el presente trabajo se analizaron los efectos de una dosis única de Malathion 1/12 DL50 a diferentes días post-administración, sobre la celularidad del epitelio seminífero y la proliferación celular en testículo de ratón adulto.

Se usaron 50 ratones adultos cepa CF-1, divididos en grupos control y experimental, cada uno dividido en 5 subgrupos. Al grupo experimental se le administró una dosis única de Malathion (1/12 DL50 ). Los animales fueron sacrificados a distintos días post-tratamiento (1, 8.5, 16, 35 y 40). El testículo derecho se procesó para técnica histológica corriente, mientras que el testículo izquierdo fue incubado por 1hr en BrdU, luego fijado en Bouin alcohólico y procesado para inmunocitoquímica (proliferación celular).

En los resultados se observó un efecto subagudo hacia crónico de la acción del Malathion 1/12 DL50 sobre las diferentes poblaciones celulares del epitelio seminífero: alterando la proliferación espermatogonial, la meoisis y la espermiohistogénesis.


EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS TÓXICOS DEL AGROPESTICIDA ORGANOFOSFORADO MALATION A NIVEL DE CABEZA DE EPIDÍDIMO DE RATÓN CF1.
(Evaluation of toxical effects of malathion on the cauda epidydymus of CF1 mouse). 1Pino-Campos, L.; Sarabia-Villar, L. & Bustos-Obregón, E. Laboratorio de Biología de la Reproducción, Programa de Morfología, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.1Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Santo Tomás.

Los organofosforados son ampliamente utilizados a nivel mundial. Su mecanismo de acción es la inhibición irreversible de acetilcolinesterasa. Dentro de este grupo, malatión es considerado ligeramente tóxico para los mamíferos, siendo su impacto en la salud reproductiva poco conocido.

El objetivo de este estudio es cuantificar el daño histológico mediante métodos morfométricos y describir características citoquímicas del fluido epididimario a nivel de cabeza de epidídimo de ratón, en controles como en expuestos. Se utilizaron ratones machos CF1, de 10 a 12 semanas de edad, los cuales se inyectaron vía i.p con una dosis única de malatión comercial al 95,2% p/p (600mg/kg que corresponde a 1/5 DL50). Los controles se inyectaron con 300 µl del vehículo (aceite de maíz). Fueron sacrificados por dislocación cervical al día 1, 8, 40 y 50 p.i. Se puede evidenciar que altura del epitelio, área del lumen y diámetro del conducto epididimario, aumentan a medida que avanzan los intervalos observados. Sin embargo, se produce una disminución significativa (p 0.05) de estos parámetros en los tratados respecto a los controles, con excepción de la altura del epitelio, que experimenta un aumento significativo (p 0.05) al día 8 p.i. Se observaron signos de alteración celular como descamación y vacuolización, principalmente el día 8. El análisis citoquímico realizado con la combinación AB (pH 1.0 y 2.5) y PAS, mostró una reacción más débil en los grupos experimentales, exhibiendo una reactividad negativa para AB a pH 1.0, lo cual indica una disminución o ausencia de mucosustancias ácidas (AB) y una disminución de mucosustancias neutras (PAS). Los cambios morfométricos, así como la presencia de células germinales inmaduras (incluso espermatocitos) en el lumen y los cambios citoquímicos, denotan efecto citotóxico en cabeza de epidídimo, causada por dosis única de malatión.

Financiamiento parcial Banco Santander Central Hispano, Madrid


PROLIFERACIÓN ESPERMATOGONIAL E HISTOPATO-LOGÍA TESTICULAR, EN PRESENCIA DE MALATIÓN (1/5 DL50), EN RATÓN
(Espermatogonial proliferation and testicular histopathology in mouse after malathion (1/5 DL50) application). Anglés, R.; Heberlein, E. & Rodríguez, H. Laboratorio de Histoembriología, Programa de Morfología. ICBM. Facultad Medicina. U de Chile.

El Malathion tiene efectos citotóxicos sobre una gama de tipos celulares e interactúa electro físicamente con ADN, ARN y proteínas, interfiriendo la proliferación celular. Se analizan los efectos de Malathion en dosis única (1/5 DL50) sobre la histología testicular y la proliferación celular del túbulo seminífero en el ratón.

En 40 ratones CF-1 (2.5 meses), separados en grupos controles (aceite de Mazole) y experimentales (inyectados intraperitonealmente con dosis única de Malathion 1/5 DL50), fueron sacrificados a los días 1; 8; 40 y 50 post-inyección. El testículo izquierdo se procesó para histología corriente; y el derecho fue incubado en BrdU (1 hora) y procesado para inmunohistoquímica. Se cuantificaron los diferentes tipos celulares de la espermatogénesis; presencia de vacuolización, discontinuidad epitelial y taponamiento tubular; e inmunohistoquímicamente se evaluó la proliferación del epitelio germinal. Los resultados se expresan en valores absolutos, porcentajes y tasas. Las pruebas de diferencias y asociaciones corresponden a pruebas de "t" y regresiones (p< 0.05).

Se observó un aumento significativo en la aparición de histopatologías en los cuatro grupos experimentales, con respecto al control. En la proliferación celular se observaron variaciones en las proporciones en las diferentes poblaciones celulares (espermatogonias) y estadios mitóticos, como también durante la meiosis y la espermiohistogénesis, con intensidades desde agudos a subagudos, según transcurre el tiempo post inyección.

El malathion en 1/5 DL50 induce un daño testicular agudo y sostenido en el tiempo durante varios ciclos de la espermatogénesis, considerando tanto la histopatología, como la celularidad del epitelio germinal.


CARACTERÍSTICAS DEL ESPERMIOGRAMA DE UNA POBLACION DE ADOLESCENTES CON Y SIN VARICO-CELE
(Characteristic of seminal analysis in young men with and without varicocele). 1Vásquez, F. & 2Bustos-Obregón, E. 1Facultad de Medicina Universidad del Norte, Barranquilla, Colombia. 2Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

El varicocele testicular es una patología reproductiva asociada a la infertilidad. Aparece generalmente en la adolescencia y produce alteraciones en los parámetros del espermiograma. Para su diagnóstico es necesario el examen físico y un doppler testicular. El objetivo es comparar los parámetros seminales de una población de adolescentes con y sin varcocele. Estos resultados forman parte de un proyecto que tiene como objetivo caracterizar el espermograma de una población de adolescentes a partir del momento de la primera eyaculación (oigarquia) . El trabajo es un estudio descriptivo transversal, formado por 161 adolescentes entre los 13 y 18 individuos y de 87 el que tiene varicocele. El espermograma se realizó bajo las normas OMS y el protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad, los padres de familia, el adolescente y las autoridades educativas del establecimiento. El volumen de semen y el pH fueron semejantes en ambos grupos. El recuento total de espermatozoides fue menor en el grupo con varicocele (78.130.000 vs 112.579.000).; igualmente hay un porcentaje mayor de individuos con recuentos más bajos (47.1% vs 29.7%). La movilidad grado 3 es mayor en el grupo sin varicocele (27.08% vs 16.7%), así como el porcentaje de formas normales (23.32 % vs 21.51%). Estos resultados insinúan que el grupo de adolescentes con varicocele presenta un mayor porcentaje de alteraciones del espermograma comparados con los que no lo tienen. Es necesario analizar los datos agrupándolos por tiempo de eyaculación para estandarizar las poblaciones y sería útil realizar un seguimiento de la población para observar si esta tendencia de alteraciones se mantiene.


VALORES DE REFERENCIA PARA SUPERÓXIDO DISMUTASA, GLUTATIÓN PEROXIDASA Y ESTADO ANTIOXIDANTE TOTAL EN SANGRE Y PLASMA SEMINAL HUMANO (Reference values for superoxide desmutase, gluthation peroxidase and total antioxidant status in human blood and seminal plasma). Vallejos, S.; López, C. & Schulz, M. 1Villegas M. 1Depto. Medicina Interna, Centro de Biotecnología en Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco.

Las especies reactivas de oxígeno (ROS), pueden alterar reversible e irreversiblemente compuestos bioquímicos y actividades celulares del espermatozoide. Para proteger a los espermatozoides del daño producido por ROS, es esencial el sistema antioxidante presente en el plasma seminal. Para poder interpretar adecuadamente los resultados que se obtengan en pacientes, es importante establecer los valores de referencia para cada población para el método que se utilizará y en las mismas condiciones en que se efectuarán los análisis. El objetivo del presente trabajo fue establecer valores de referencia para superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GPx) y estado antioxidante total (TAS), en sangre y plasma seminal humano.

Para determinar los valores de referencia de SOD, GPx y TAS, se analizaron muestras de sangre y plasma seminal de 30 donantes voluntarios, de sexo masculino, cuyas edades fluctuaron entre los 18 y 25 años. El análisis de las muestras se realizó mediante kits comerciales Randox.

Los valores de referencia obtenidos fueron los siguientes:

SOD eritrocitos
plasma seminal
354,8 - 4073,8 U/g de Hb
6,04 - 30,97 U/mL
GPx sangre
plasma seminal
11,22 - 74,13 U/g de Hb
117,76 - 445,66 U/L
TAS plasma sanguíneo
plasma seminal
0,23 - 3,45 mmol/L
1 ,42 - 3,60 mmol/L

Se discuten los valores de referencia encontrados en nuestra población comparándolos con los encontrados en la literatura.

Financiado por Fondecyt 1010729-2001


DETERMINACIÓN DE PERÓXIDOS LIPÍDICOS EN ESPERMATOZOIDES DE UN GRUPO DE HOMBRES APARENTEMENTE SANOS
(Determination of sperm lipid peroxides in healthy men). Negrier, J.; Bizama, C.; Sepúlveda, A. & 1Villegas, J. 1Departamento Medicina Interna, Centro Biotecnología Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco.

Los espermatozoides experimentan peroxidación de los fosfolípidos de la membrana plasmática, resultando en disminución de la movilidad. Un método para la determinación de peroxidación lipídica es la reacción del ácido tiobarbitúrico (TBA), con malondialdehído (MDA), un subproducto de la lipoperoxidación.

El objetivo del presente trabajo fue determinar la concentración de MDA en los espermatozoides de un grupo de hombres aparentemente sanos.

Se analizaron muestras de líquido seminal de 20 voluntarios. Para la reacción del TBA, 20 x 106 espermatozoides humanos se incubaron con sulfato ferroso 0,2 mM y ascorbato de sodio 1 mM. Luego de 1h de incubación a 37C, la suspensión celular se desproteinizó con 20% de TCA. El sobrenadante se incubó a 90C durante 10m, luego de la adición de TBA al 2%. La reacción de color se cuantificó espectrofotométricamente.

Al analizar los resultados obtenidos se encontró que los datos no seguían una distribución normal.

MDA (ng/ml)
N promedio s moda mediana
20 782,9 382,7 601.4 713,7

Uno de los aspectos más importantes en el análisis clínico es la interpretación de los datos obtenidos con la finalidad de contribuir al diagnóstico y tratamiento de los pacientes. No conociéndose datos previos de valores de referencia para el método TBA en espermatozoides humanos, este estudio proporciona datos preliminares de los valores que pueden encontrarse en una población aparentemente normal.

Financiado por Fondecyt 1010729-2001


EFECTO DE ROS PRODUCIDO POR LEUCOCITOS ACTIVADOS SOBRE EL NIVEL DE APOPTOSIS EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS. (
Effect of ros produced by leukocytes on human sperm apoptosis). Schulz, M.; 1-3Sánchez, R.; 4Miska, W. & 2-3Villegas, J. 1Depto. de Ciencias Preclínicas; 2Depto. de Medicina Interna, 3Centro de Biotecnología en Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera; 4Depto. de Dermatología y Andrología, JL University of Giessen, Giessen, Alemania.

Altas concentraciones de especies reactivas del oxígeno (ROS), producen daño en la integridad de la membrana celular y del ADN del espermatozoide. Es así como se ha asociado la presencia de ROS con un aumento de la apoptosis o muerte celular programada en el espermatozoide.

El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de ROS producido por leucocitos activados sobre los niveles de apoptosis en espermatozoides humanos.

Los espermatozoides fueron aislados del plasma seminal mediante centrifugación en gradiente de Percoll; y los granulocitos polimorfonucleares (PMN) purificados de sangre periférica mediante una combinación de centrifugación en gradiente de Hipaque 1.077 y sedimentación en polivinil-alcohol al 1%. Se co-incubaron espermatozoides con PMN en presencia y ausencia del activador PMA. Para medir el nivel de apoptosis se utilizó un kit comercial de Anexina V- FITC y citometría de flujo. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t para muestras pareadas con un nivel de significancia de 0.05.

El análisis de las diferencias entre los niveles basales de apoptosis de los espermatozoides y los niveles post incubación con leucocitos activados fue estadísticamente significativa (p < 0.05). En cambio no se encontraron diferencias significativas entre los niveles basales de apoptosis y los niveles de apoptosis post incubación con polimorfonucleares sin activar.

Financiado por Fondecyt 1010729-2001


INDUCCIÓN DE APOPTOSIS EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS INCUBADOS CON LEUCOCITOS ACTIVADOS POR BACTERIAS (Activated leukocytes by bacteria induce apoptosis in human spermatozoa). Schulz, M.; 2Villegas, J.; 1Soto, L.; 1Iglesias, T. & 1Sánchez, R. 1Depto. de Ciencias Preclínicas; 2Depto. de Medicina Interna, Centro de Biotecnología en Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco.

La presencia de bacterias en el líquido seminal tiene efecto sobre la activación leucocitaria, generando elevadas concentraciones de ROS. Este aumento de ROS puede afectar no sólo la función del espermatozoide sino también la integridad de la membrana celular y del ADN, induciendo apoptosis o muerte celular programada.

El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de ROS producido por leucocitos activados por bacterias sobre los niveles de apoptosis en espermatozoides humanos.

La células espermáticas se aislaron del plasma seminal mediante centrifugación en gradiente de Percoll y los granulocitos polimorfonucleares (PMN), purificados mediante una combinación de centrifugación en gradiente con Hipaque 1.077 y sedimentación con polivinil-alcohol al 1%. Los espermatozoides fueron co-incubados con PMN y una de las siguientes especies bacterianas: Enterococcus faecalis, Stafylococcus epidermidis, Escherichia coli y Stafylococcus aureus.

Para el análisis estadístico se utilizó un análisis de Varianza con un nivel de significación de p < 0.05.

El análisis de las diferencias entre los niveles basales de apoptosis de los espermatozoides y niveles posteriores a la incubación con leucocitos activados con las respectivas especies bacterias, demostro diferencias estadísticamente significativas (p < 0.05). Estos resultados nos permiten concluir que los niveles de ROS producto de la activación leucocitaria por estimulación bacteriana inducen un aumento en los niveles de apoptosis en espermatozoides humanos.

Financiado por Fondecyt 1010729-2002


IMPORTANCIA DE LA BIOPSIA TESTICULAR EN LOS PROGRAMAS DE FECUNDACIÓN IN VITRO (Importance of testicular biopsies in IVF programs). 1-3Vasconcellos, A.; 1-3Peña, P.; 1Gorena, M.; 1Hinostroza, J.A.; 1Orio, M. & 2-3Sánchez, R. 1Departamento de Ciencias Básicas; 2Departmento de Ciencias Preclínicas; 3Centro de Biotecnología en Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco.

La biopsia testicular es un método que se practica en forma sistemática para evaluar la función testicular en pacientes con azoospermia y oligozoospermia severa. Relacionadas a la biopsia testicular hay algunas áreas que han tenido gran desarrollo recientemente y estas incluyen procesamiento del tejido testicular, crioconservación y recuperación de espermatozoides, maduración de espermatozoides in vitro y microinyección de precursores de células espermatogénicas inmaduras. Esto ha permitido que se realice simultáneamente la biopsia testicular con la crioconservación del tejido testicular para que sin reintervenir quirúrgicamente al paciente, se inicie un ciclo de fecundación in vitro, teniendo la certeza contar con espermatozoides o células precursoras para las técnicas de micro-injección de ovocitos. Tiene además la ventaja de que el tejido congelado puede servir para multiples ciclos ICSI. Recientemente hemos iniciado el programa de congelación de tejido testicular y se presentan lo primeros casos que incluyen diagnostico de detención de la espermatogenesis, síndrome de sertoli solo y atrofia e hialinización tubular severa, permitiendo entregar un diagnóstico definitivo del pronóstico fértil del paciente.


EFECTO DE AGENTES CRIOPROTECTORES SOBRE la preservaciÓn del ACRosoma (Effect of cryoprotectant substances on acrosome preservation). 1-3Deppe, M.; Ortloff, C.; Salinas, G.; Bravo, D. & 2-3Sánchez, R. 1Depto. de Ciencias Básicas; 2Depto. de Ciencias Preclínicas, 3Centro de Biotecnología en Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco.

La incubación de espermatozoides de mamíferos a 4C por 20 horas y posterior aumento de la temperatura a 37C, implica cambios en la fluidez de membrana induciendo reacción de acrosoma (RA). Sin embargo este efecto debe ser evitado cuando se somete a los espermatozoides a procesos de crío conservación. En este proceso los espermatozoides son incubados a 4C previo a la etapa de congelación en nitrógeno líquido y posteriormente en el proceso de descongelación llevados 37C. La inducción de RA a bajas temperaturas ha sido utilizada en la evaluación de la función del espermatozoide. En este estudio, esta técnica fue utilizada para evaluar el efecto de los crío conservantes (CP) en la protección del acrosoma. Espermatozoides de donantes fueron seleccionados por técnica de migración-sedimentación, incubados en HTF, adicionado con dimetil sulfóxido (DMSO) al 1 M, etilen glicol (EG) al 0,75 M y glicerol al 1M a 4C y a 20C por 18 horas, y luego 3 horas a 37C en estufa de cultivo. La RA fue evaluada por triple tinción en 100 espermatozoides viables.

En las muestras incubadas por 18 horas a 4C, se observó un importante aumento de espermatozoides reaccionados en las muestras incubadas con glicerol (24%, p < 0.005 respecto al control y EG) y DMSO (20.66%, p < 0.05 respecto al control y EG), no observándose este efecto en la muestra con EG (4.33% de RA). El control fue de 9%. Con la incubación adicional por 3 horas a 37C, no se observó un aumento significativo en ninguna de las muestras de espermatozoides tratados con CP. Al comparar los CP entre sí, en estas mismas muestras, aquellas incubadas con EG mostraron un menor porcentaje de RA en relación con las incubadas con glicerol y DMSO, siendo esta diferencia significativa tanto para glicerol (p<0.025) como para DMSO (p<0.0125).

Las muestras de espermatozoides incubadas con CP por 18 horas a 20C mas 3 horas a 37C, mostraron un aumento en el porcentaje de RA de un 12.6% para las tratadas con glicerol, de un 6.0 % con DMSO y 0% EG con relación a las muestras sin incubación adicional.

La presencia del acrosoma y la preservación de su función es esencial para el potencial fecundante del espermatozoide. Este estudio evidencia que dentro de los CP evaluados, el EG presenta un mayor efecto protector para la preservación del acrosoma.

Financiado por Fondecyt 1010729-2001


ARACNO-TOXINA ALTERA LA RESPUESTA A PROGESTERONA INDUCIENDO CAMBIOS DE [Ca2+]i y pHi EN ESPERMATOZOIDE HUMANOS (Aractoxin modifies the response to progesterone in human sperm inducing [Ca2+]i and pHi changes). 14Romero, F.; 1-4Sánchez, R.; 2Ferreira, A. T; 2Oshiro, M. E. M. & 3Cunha, M. A. 1Depto. de Ciencias Preclínicas; 4Centro de Biotecnología en Reproducción, Facultad de Medina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile; 2UNIFESP, Escola Paulista de Medicina, Depto. Biofísica, São Paulo, Brasil; 3UNIFESP, Escola Paulista de Medicina, Depto. Nefrología, São Paulo, Brasil.

La regulación de [Ca2+]i es importamte para la maduración, capacitación y reacción de acrosoma del espermatozoide. La progesterona puede inducir reacción de acrosoma a travéz de un aumento transitorio de [Ca2+]i estimulando receptores de la membrana plasmática ubicados en la región acrosomal. La Aracnotoxina (Atx, el extracto crudo), extraída del veneno de la araña Latrodectus mactans de Chile induce activación de los canales de [Ca2+]i. El objetivo es determinar las variaciones en [Ca2+]i y pHi en espermatozoides capacitados estimulándolos con progesterona y Atx. Los espermatozoides fueron obtenidos de 8 donantes sanos (Servicio de Fertilidad, Hospital São Paulo, Brasil), aislados por la técnica "Swin up" a 37C en medio BWW con 3 mg de albúmina/ml, pH 7,4. [Ca2+]i y pHi se determinó antes y después del estímulo con progesterona 20 µM y CO Atx 76 ng/ml. En espermatozoides capacitados el nivel de basal de [Ca2+]i fue de 117 nM y después de estimular con 20 µM de progesterona esta indujo una respuesta bifásica que se presenta como un aumento transitorio inicial de [Ca2+]i de un 28% (155nM) seguido por un componente lento, la adicción de Atx indujo un incremento de[Ca2+]i en un 44% con relación al control. En experimentos en que se estimula primero con Atx (76 ng/ml) se aumento la concentración [Ca2+]i, pero la posterior adicción de progesterona no indujo efecto en el [Ca2+]i. En la determinación del pHi los espermatozoides presentaron un pH estable en condiciones basales, que aumenta trasitoriamente en presencia de progesterona y que disminuye dramáticamente en presencia de Atx.

En conclusión, el aumento en [Ca2+]i inducido por progssterona es consecuencia de la activación de receptores (P4) que se expresan en membranas celulares de Ca2+ por progesterona y Atx, indica posiblemente movilización de Ca2+ de sitios extracelulares y/o intracelulares (acrosoma). Por otra parte, al inducirse la caída del pHi por atx, nos permite postular la activación del intercambiador Na+/H+, lo que acidifica el medio intracelular del espermatozoide.

Financiado por DIUFRO 120242, Fondecyt 1010729-2001 y 7010729, CNPq, FAPESP


EFECTO DE LA LISOFOSFATILCOLINA EN LA INDUCCIÓN DE LA REACCIÓN DEL ACROSOMA DE ESPERMATOZOIDES CANINOS
(Effect of lysophosphatidil choline on the induction of acrosome reaction in canine spermatozoa). 1Santiani, A; 1Hoesel, J.; 2Risopatrón, J.; 4Sepúlveda, N. & 3Sánchez, R.1Centro de Biotecnología en Reproducción; 2Depto. de Ciencias Básicas; 3Depto. de Ciencias Preclínicas, Facultad de Medicina; 4Depto. de Producción Agropecuaria, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de La Frontera, Temuco-Chile.

Los lisofosfolípidos en el espermatozoide desestabilizan la membrana plasmática y promueven su fusión con la membrana acrosómica externa, acelerando la reacción del acrosoma (RA). La lisofosfatidilcolina (LC) ha sido utilizada para inducir RA en espermatozoides capacitados de diferentes especies de mamíferos. El presente estudio evalúa por primera vez el efecto de la LC en la inducción de la RA en espermatozoides caninos. Espermatozoides de caninos fueron separados del plasma seminal por el método lavado-centrifugación e incubados por 3 y 4 horas en un medio capacitante (mCCM), al final del periodo de capacitación se indujo RA con LC (100mg/ml) por 15 minutos. La determinación del acrosoma en espermatozoides viables se realizó mediante la técnica de doble fluorescencia Hoechst-FITC-PSA. La prueba de análisis de varianza (ANOVA) en bloques se utilizó para el análisis estadístico.

Los porcentajes de espermatozoides viables con RA en los grupos tratados con LC y los controles al momento de inicio del experimento (21.0±6.6% vs. 21.0±4.2%), a las 3 horas (49.1±5.2% vs. 43.8±4.7% y a las 4 horas de incubación (57.6±9.9% vs. 51.3±14.8%) no demostraron diferencias estadísticamente significativas (p>0.05). No obstante, se observaron diferencias significativas (p<0.01) por efecto del tiempo de incubación en el porcentaje de espermatozoides viables reaccionados.

La LC no ejerce un efecto significativo en la inducción de la reacción acrosómica en espermatozoides caninos incubados en medio mCCM sin glucosa, mientras que el tiempo de incubación si afecta el porcentaje de espermatozoides viables reaccionados.

Financiado por DIUFRO 130204


EFECTO DE LA PROGESTERONA SOBRE EL DESARROLLO DE LA ONDA FOLICULAR OVÁRICA EN LLAMAS (Lama glama) (Effect of progesterone on the development of ovarian follicular cycle in llamas (Lama grama)).1-3Santiani, A.; 1Leyva, V.; 1García, W. & 1, 2-3 Sepúlveda, N. 1Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima,Perú. 2Facultad de Ciencias Agropecuarias y Forestales; 3Centro de Biotecnología en Reproducción, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

La presencia de un folículo dominante inhibe el crecimiento de folículos pequeños. La progesterona ha sido utilizada para inducir la regresión del folículo dominante en rumiantes, y permitir ovulaciones múltiples. El presente estudio tiene como objetivo de estudiar por primera vez el efecto de la progesterona sobre el desarrollo de la onda folicular ovárica en llamas. Se seleccionaron al azar 25 hembras adultas receptivas sexualmente y que a la ecografía presentaban un folículo 7 mm. Los animales fueron distribuidos en los siguientes grupos: G0 (control), G1 (30 mg de P4 por 2 días), G2 (30 mg de P4 por 4 días), G3 (50 mg de P4 por 2 días) y G4 (50 mg de P4 por 4 días). Diariamente se monitoreó el desarrollo de los folículos dominante (7mm) y subordinados (>3 mm y <7mm) por ecografía transrectal de los ovarios.

El tamaño mínimo alcanzado por el folículo dominante en los grupos G1 (4.6±0.89 mm), G3 (5.1±1.54 mm) y G4 (5.3±1.57 mm) fue menor (p<0.05) al grupo control (8.5±1.0 mm). El grado de regresión folicular diario en los grupos G1 (1.28±0.43 mm), G2 (0.93±0.39 mm), G3 (0.87±.37 mm) y G4 (1.09±0.31) fue mayor (p<0.05) al grupo control (0.15±0.19) mm. La regresión total del folículo dominante en los grupos G1 (5.5±2.0 mm), G2 (5.9±1.39 mm) y G3 (5.3±3.33) fue mayor (p<0.05) al grupo control (0.87±1.43). Se demuestra que la progesterona exógena induce la regresión del folículo dominante, permitiendo el surgimiento de una nueva onda folicular.


CONCENTRACIONES PLASMÁTICAS DE TESTOSTERONA MÁXIMA EN CARNEROS COMO RESPUESTA A LA APLICACIÓN DE GnRH
(Maximal concentrations of plasmatic testosterone after GnRh application in ram). 1Andaur, M.; 2Santiani, A.; 3Sepúlveda, N. 1Universidad Católica de Temuco; 2Universidad de San Marcos, Perú; 3 Depto. Producción Agropecuaria, Centro de Biotecnología en Reproducción (CEBIOR), Universidad de La Frontera, Temuco.

Se estudió el patrón de secreción de testosterona después de la aplicación de GnRH en 6 carneros de la raza Romney Marsh. Para tal efecto los animales fueron inyectados intramuscularmente con distintas concentraciones de un análogo de GnRH (acetato de buserelina, Conceptal® , Lab. Hoechst). Se obtuvieron muestras de sangre, desde la vena yugular, antes y cada 20 minutos después de la aplicación del GnRH. Desde las muestras de sangre se extrajo el suero y se congelaron hasta ser analizadas mediante técnicas de electroquimioluminiscencia utilizando un equipo ELECSYS 1010 y el kit testosterona (ROCHE Diagnóstica).

Se determinó la curva de secreción de testosterona después de la aplicación de 0,004 mg de buserelina obteniéndose una secreción máxima de testosterona 2,5 horas después de aplicada el GnRH con valores que alcanzan un promedio de 23 ng/ml de testosterona plasmática.

También se estudió el efecto de la aplicación de altas dosis (0,012 mg de buserelina) y dosis reducidas (0,002 mg. de buserelina) de GnRH para provocar la secreción de testosterona. Se observó que existe un efecto en la respuesta, que es dependiente de la dosis, ya que con dosis altas la respuesta alcanzó en promedio 23, 4 ng/ml y la respuesta con dosis reducidas a los 14,1 ng/ml.

Se concluye que el patrón de secreción de testosterona máxima después de la aplicación de GnRH en carneros, es similar al reportado en toros, sin embargo se observó que es dependiente de la dosis de GnRH aplicada.

Financiado por DIUFRO 130-209


VALIDACIÓN DEL MÉTODO DEL ÁCIDO TIOBARBI-TÚRICO PARA DETERMINAR PERÓXIDOS LIPÍDICOS EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS.
(Validation of the thiobarbituric acid method for lipid peroxides determination in human sperm). Sepúlveda, A.; Bizama, C.; Negrier, J. & 1Villegas J. 1Depto. Medicina Interna, Centro de Biotecnología en Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco.

A causa de la exposición al oxígeno, los espermatozoides de mamíferos experimentan peroxidación de los fosfolípidos de la membrana plasmática, resultando en disminución de la movilidad. Para la determinación de peroxidación lipídica se usa la reacción del ácido tiobarbitúrico (TBA), con malondialdehído (MDA), un subproducto de la lipoperoxidación. El objetivo de este trabajo fue validar el método del TBA para su aplicación en espermatozoides humanos.

Se realizó espectro de absorción y curvas de calibración con una solución de MDA-TBA obtenida mediante hidrólisis ácida de bis-dimetilacetal. Para el método TBA, los espermatozoides se incubaron con sulfato ferroso 0,2 mM y ascorbato de sodio 1 mM. Luego de 1h de incubación a 37C, la suspensión celular se desproteinizó con 20% de TCA. Al sobrenadante se agregó TBA al 2%, se incubó a 90C durante 10m y el desarrollo del color se cuantificó espectrofotométricamente.

El peak máximo de absorbancia para el complejo MDA-TBA se observó a 532 nm. Las curvas de calibración siguieron la ley de Beer y el factor de calibración fue 2.340,0. El método es sensible hasta una concentración 8 x 106 espermatozoides. En los sobrenadantes conservados hasta 55 días, no hubo variaciones significativas de la concentración de MDA.

Se concluye que el método TBA es adecuado para la determinación de peróxidos lipídicos en espermatozoides humanos.

Financiado por Fondecyt 1010729-2001


COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DE RECUPERACIÓN DE OVOCITOS EQUINOS
(Comparison of two methods for recover equine oocytes ). Sepúlveda, J.; Silva, M. & Berland, M. Lab. de Reproducción Animal, Escuela de Medicina Veterinaria, U.Católica de Temuco.

La baja disponibilidad de material biológico en plantas de faenamiento equino y la baja eficiencia de colección de ovocitos de los métodos tradicionalmente utilizados en otras especies, hacen que el número de complejos cúmulo ovocito (CCO) disponibles para estudios de maduración in vitro en equinos sea limitado. La forma más sencilla y económica de aspiración folicular, es utilizando una aguja y jeringa. Los porcentajes de recuperación de ovocitos equinos por aspiración folicular manual, resultan relativamente menores que los obtenidos en bovinos, con una gran proporción de ovocitos denudados de las células del cúmulo El objetivo de este trabajo fue evaluar la eficiencia de recuperación de ovocitos mediante aspiración o lavado folicular manual y evaluar la morfología de los CCO recuperados por cada uno de estos métodos.

En 177 ovarios fueron aspirados 598 folículos (3,4 folículos por ovario). Se obtuvieron 343 ovocitos, con una tasa de recuperación del 57.4 %. Del total de los CCO recuperados 268 (78.1%) fueron obtenidos por lavado folicular y sólo 75 (21,9%) fueron obtenidos mediante aspirado folicular. Del total de CCO recuperados por el método de aspirado folicular el 64% poseía un cumulus íntegro (ya sea compacto o expandido), y el restante 36% presentó daños en esta estructura o en su citoplasma (denudados, sólo con corona radiada y degenerados). En cambio en los CCO recuperados por el lavado folicular sólo el 50,4% presentó cumulus íntegros y el restante 48,6% presentó daños, determinándose diferencias significativas entre ambos métodos (P< 0,05). En el grupo de lavado folicular existe una alta proporción de ovocitos que están rodeados por corona radiada solamente, lo que podria implicar un denudado accidental de las células del cúmulo que rodean al ovocito. Podemos concluir que el sistema de lavado folicular mejora en forma sustancial la tasa de recuperación de ovocitos equinos, sin embargo, los complejos CCO recuperados mediante el lavado folicular presentan significativamente un mayor daño en el cúmulo que los recuperados mediante el aspirado folicular.


EFECTO DE LA ADICIÓN DE CÉLULAS DE GRANULOSA AL MEDIO TCM199 SOBRE LA TASA DE MADURACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS EQUINOS
(Effect of adding granulose cells to TCM 199 medium on the in vitro maturation rate in equine oocytes). Sepúlveda, J.; Silva, M. & Berland, M. Lab. de Reproducción Animal, Escuela de Medicina Veterinaria, Universidad Católica de Temuco.

Las tasas de maduración in vitro de ovocitos equinos son del 50 al 75%, las cuales son menores a las obtenidas en otras especies. Existen antecedentes, para ovocitos bovinos y porcinos, que la suplementación del medio de maduración in vitro con células de la granulosa mejora la tasa de maduración, sobre todo de aquellos ovocitos desnudos o con menos capas de células del cúmulo. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la adición de células de la granulosa al medio de maduración sobre la tasa de maduración in vitro de ovocitos equinos. Los complejos cumulus ovocito (CCO) fueron obtenidos por aspiración y lavado de folículos entre 5 y 30 mm de diámetro. Los CCO recuperados fueron clasificados, según la morfología del cúmulo y citoplasma, en aptos y no aptos para la maduración. Una vez seleccionados los CCO fueron lavados 2 veces en el medio utilizado para la maduración y posteriormente distribuidos al azar en dos grupos:

Grupo control: TCM199 (10% suero de yegua en estro, FSH 10 µg/ml, LH 5 µg/ml, piruvato 0,2mM, 17 b estradiol 1 µg/ml y gentamicina 0,5 µg/ml).

Grupo tratamiento: TCM199 (10% suero de yegua en estro, FSH 10 µg/ml, LH 5 µg/ml, piruvato 0,2mM, 17 b estradiol 1 µg/ml y gentamicina 0,5 µg/ml), adicionado con 1µl de células de la granulosa. La comparación de las proporciones de ovocitos madurados en cada uno de los grupos se realizó utilizando la prueba de Chi2. En el grupo tratamiento se obtuvo una tasa de maduración de ovocitos del 73% y en el grupo control del 63%, no observándose una diferencia significativa entre grupos (P> 0,05). Los resultados obtenidos no apoyan las evidencias obtenidas en la maduración in vitro de ovocitos de otras especies animales, referentes al incremento en tasas de maduración al utilizar células somáticas (granulosa) en los cultivos ovocitarios. Podemos concluir entonces que la adición de células de la granulosa al medio de cultivo TCM199 no modifica significativamente la tasa de maduración in vitro de ovocitos equinos.


EVALUACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE MEMBRANA ESPERMÁTICA EN SEMEN CANINO DILUÍDO Y REFRIGERADO
(Evaluation of sperm membrane integrity in diluted and refrigerated canine semen). Cartagena, A.; Sánchez, A. & Berland, M. Laboratorio de Reproducción Animal, Escuela de Medicina Veterinaria Universidad Católica de Temuco.

En la actualidad y dado que la reproducción y crianza de perros es una afición de distribución mundial, la preservación del semen y la inseminación artificial (IA) se han constituido en temas de alto interés para Médicos Veterinarios y criadores. La incorporación de técnicas de valoración espermática como la prueba hipoosmótica (P.H.) permitirían complementar el espermiograma convencional. La refrigeración del semen es una alternativa para preservar espermatozoides potencialmente fértiles y facilitar el transporte y la inseminación de hembras en lugares geográficos distantes de los machos. Con el propósito de estudiar la respuesta hipoosmótica de espermatozoides caninos diluidos y refrigerados, se obtuvieron 20 eyaculados (2da fracción) que fueron fraccionados, diluidos en relación 1:3 con los siguientes diluyentes seminales: EYT: Yema de huevo + TRIS + Glucosa + antibiótico (365 mOsm/kg; pH 6.8) y LD: Leche Descremada UHT + antibiótico (272 mOsm/kg; pH 6.8), y refrigerados a 4° C hasta por 96 hrs. La evaluación del semen fresco arrojó los siguientes resultados (%): Motilidad (M.P.) 95.7 ± 3.6; Vitalidad (V.E.) 86.5 ± 4.5 y Morfología Normal (M.N.) 87.7 ± 6.9. La integridad de membrana se evaluó como porcentaje de espermatozoides que responden a la P.H. (solución de fructosa + citrato de Na: 60 mOsm/kg). La correlación entre M.P. y P.H. en semen fresco fue r = 0.35 (p < 0.001). En el diluyente EYT entre las 24 y 96 hrs. la M.P. fluctuó entre 93.0 ± 4.5 y 85.40 ± 6.5 y la P.H. entre 75.4 ± 10 y 73.2 ± 8.6. Los valores de M.P. y P.H. para el diluyente LD fueron significativamente inferiores comparados con EYT en todos los tiempos, sin embargo cabe destacar que la M.P. se mantuvo sobre el 70 % considerado como valor mínimo para uso de semen canino en IA. Las correlaciones entre M.P. y P.H. en el semen refrigerado fueron r = 0,39 (p < 0.001) y r = 0,37 (p < 0.001) para los diluyentes EYT y LD respectivamente. En conclusión, se puede señalar que la prueba hipoosmótica constituye una alternativa para complementar los exámenes seminales de rutina en la especie canina. Además, ambos diluyentes en estudio arrojaron valores de motilidad progresiva, considerados como satisfactorios (> 70 %), hasta por 96 horas de refrigeración.

Financiado por Fondo de Apoyo a la Ejecución de Tesis de Pregrado, DIUCT 2001


ALFA GLUCOSIDASA ÁCIDA Y NEUTRA EN PLASMA SEMINAL HUMANO. I.-IMPORTANCIA DE SU EVALUACIÓN EN EL PACIENTE ANDROLÓGICO
(Acid and neutral glucocidase in human seminal plasma. I. Importance of its evaluation in andrological patients). Cerda, C.; Aguilera, I.; Peña-Rehbein, P.; 4Miska, W.; 2-3Sánchez, R. & 1-3Peña, P. 1Depto. de Ciencias Básicas; 2Depto. de Ciencias Preclínicas; 3Centro de Biotecnología de Reproducción, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco; 4Depto. Andrología, JL-University of Giessen, Giessen, Alemania.

La alfa glucosidasa(a-Gl) es una de las enzimas que normalmente se encuentra en el plasma seminal humano (PSh). Bioquímicamente se han detectado dos isoformas que morfológicamente se han localizado en el epidídimo (Isoforma neutra, In, 80 % del total) y la próstata (isoforma ácida, Ia, 20%). En trabajos previos hemos determinado valores normales de la In para nuestra población, y sus niveles en pacientes con diferentes patologías andrológicas. El objetivo del presente trabajo fue cuantificar bioquímicamente la actividad de la a-Gl, en sus dos isoformas, para evaluar el compromiso del órgano de origen en pacientes con infección seminal. Paralelamente se estudió la recuperación de la secreción a-Gl-In en muestras seriadas de pacientes oligoespermicos colectadas para crioconservación. Semen de donantes (n=46, 18 ­ 45 años), clasificados según espermiograma y diagnóstico clínico, como normales (N; n=12), con infección (Inf; n=8), oligospermicos (Ol,=22), y vasectomizados (Vx=4), fueron centrifugadas para la separación del PSh. Las muestras se mantuvieron a (-) 20C hasta el ensayo. La actividad enzimática se determinó con la técnica de Chapdelaine modificada. Los resultados mostraron que el grupo de pacientes con infección presentó una clara elevación de ambas isoformas. Sin embargo, la In fue la que reveló valores mas altos (39 µU/ml) comparados con su equivalente en donantes normales (11.22 µU/ml). Las muestras seriadas de donantes oligospermicos mostraron un descenso inicial al día 2, (basal de 19.53 µU/ml a 11.05 µU/ml). Al día 4 comienza su incremento (14.96 µU/ml), para al día 8 ya estar totalmente recuperada (22.80 µU/ml). Nuestros resultados preliminares justifican mayores estudios que clarifiquen el status de a-Gl y su valor diagnóstico fundamentalmente en procesos inflamatorios.

Financiado por DFG-GTZ-93.2157.106.100 y Diufro 130204


II REUNIÓN ANUAL SOCIEDAD DE ANDROLOGÍA Y GAMETOLOGÍA DE CHILE. IV JORNADAS

INTERNACIONALES DE MEDICINA REPRODUCTIVA Y BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN

EL EMBRIÓN DE POLLO COMO MODELO PARA EL ESTUDIO DE EMBRIOLOGÍA EXPERIMENTAL: IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS GERMINALES PRIMORDIALES (CGP). Acosta, A.; Acuña, P.; Alam, V.; Aranda, P.; Betancourt,V.; Varas, M.A.; Rojas, M. & Araya, M.

EFECTOS DEL PARATHION COMERCIAL SOBRE ESPERMATOZOIDES DE RATÓN OBTENIDOS DE CAUDA EPIDIDIMARIA. Castro, C.; Czwiklitzer, G.; Sarabia Villar, L. & Bustos Obregón, E.

ESTUDIO DE TINCIONES APLICADAS AL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DEL TEJIDO TESTICULAR. Dalbosco, D.; Espinoza, C.; Game, D.; Osorio, F.; Pereira, N.; Valenzuela, F.; Sarabia Villar, L. & Bustos Obregón, E.

INFLUENCIA DE MALATHION®, EN EL SISTEMA REPRODUCTOR MASCULINO DE LOMBRIZ DE TIERRA, Eisenia foetida. UNA ESPECIE BIOCENTI-NELA. Espinoza, O.; Bustos-Obregón, E.

EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO SOBRE EL TEJIDO TESTICULAR EN EL ROEDOR Octodon degus. Castro, G.; Sarabia, L.; Bustos-Obregón, E. & Esponda, P.

EFECTO DEL MALATHION® EN LA MIGRACIÓN Y COLONIZACIÓN DE CÉLULAS GERMINALES DE POLLO. Goelkel, A.; Rojas, M., Bustos-Obregón, E.

PROLIFERACIÓN CELULAR EN EL TESTÍCULO LUEGO DE UNA DOSIS ÚNICA DE MALATIÓN. González-Hormazábal, P. & Bustos-Obregón, E.

DESARROLLO DE EMBRIONES PREIMPLANTACIONALES DE RATÓN OBTENIDOS POR APAREAMIENTO DE MACHOS QUE INGIRIERON Erythrina falcata Benth (Fabaceae) Gutiérrez-Pajares, J. L.

LOCALIZACIÓN EXTRACELULAR DEL PROTEASOMA EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS. Morales, P.; Pizarro, E.; Kong, M.; Pasten, C. & Jara, M.

EFECTOS DEL MALATIÓN EN DOSIS ÚNICA (1/12 DL50) SOBRE LA HISTOLOGÍA TESTICULAR DEL RATÓN Mosella, F.; Sosa, O.; Saavedra, M. & Rodríguez, H.

EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS TÓXICOS DEL AGROPESTICIDA ORGANOFOSFORADO MALATION A NIVEL DE CABEZA DE EPIDÍDIMO DE RATÓN CF1. Pino-Campos, L.; Sarabia-Villar, L. & Bustos-Obregón, E.

PROLIFERACIÓN ESPERMATOGONIAL E HISTOPATOLOGÍA TESTICULAR, EN PRESENCIA DE MALATIÓN (1/5 DL50), EN RATÓN. Anglés, R.; Heberlein, E. & Rodríguez, H.

CARACTERÍSTICAS DEL ESPERMIOGRAMA DE UNA POBLACION DE ADOLESCENTES CON Y SIN VARICO-CELE. Vásquez, F. & Bustos-Obregón, E.

Valores de referencia para superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y estado antioxidante total en sangre y plasma seminal humanO. Vallejos, S.; López, C. & Schulz, M. Villegas M.

DETERMINACIÓN DE PERÓXIDOS LIPÍDICOS EN ESPERMATOZOIDES DE UN GRUPO DE HOMBRES APARENTEMENTE SANOS. Negrier, J.; Bizama, C.; Sepúlveda, A. & 1Villegas, J.

EFECTO DE ROS PRODUCIDO POR LEUCOCITOS ACTIVADOS SOBRE EL NIVEL DE APOPTOSIS EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS. Schulz, M.; Sánchez, R.; Miska, W. & Villegas, J.

INDUCCIÓN DE APOPTOSIS EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS INCUBADOS CON LEUCOCITOS ACTIVADOS POR BACTERIAS. Schulz, M.;Villegas, J.; Soto, L.; Iglesias, T. & Sánchez, R

IMPORTANCIA DE LA BIOPSIA TESTICULAR EN LOS PROGRAMAS DE FECUNDACIÓN IN VITRO. Vasconcellos, A.; Peña, P.; Gorena, M.; Hinostroza, J.A.; Orio, M. & Sánchez, R.

EFECTO DE AGENTES CRIOPROTECTORES SOBRE la preservaciÓn del ACRosoma. Deppe, M.; Ortloff, C.; Salinas, G.; Bravo, D. & Sánchez, R.

ARACNO-TOXINA ALTERA LA RESPUESTA A PROGESTERONA INDUCIENDO CAMBIOS DE [Ca2+]i y pHi EN ESPERMATOZOIDE HUMANOS. Romero, F.; Sánchez, R.; Ferreira, A. T; Oshiro, M. E. M. & Cunha, M. A.

Efecto de la lisofosfatidilcolina en la inducción de la reacción del acrosoma de espermatozoides caninos. Santiani, A., Hoesel, J.; Risopatrón, J.; Sepúlveda, N. & Sánchez, R.

Efecto de la progesterona sobre el desarrollo de la onda folicular ovárica en llamas (Lama glama). Santiani, A.; Leyva, V.; García, W. & Sepúlveda, N.

CONCENTRACIONES PLASMÁTICAS DE TESTOSTERONA MÁXIMA EN CARNEROS COMO RESPUESTA A LA APLICACIÓN DE GnRH. Andaur, M.; Santiani, A.; Sepúlveda, N.

VALIDACIÓN DEL MÉTODO DEL ÁCIDO TIOBARBITÚRICO PARA DETERMINAR PERÓXIDOS LIPÍDICOS EN ESPERMATOZOIDES HUMANOS. Sepúlveda, A.; Bizama, C.; Negrier, J. & Villegas J.

COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS DE RECUPERACIÓN DE OVOCITOS EQUINOS. Sepúlveda, J.; Silva, M. & Berland, M.

EFECTO DE LA ADICIÓN DE CÉLULAS DE GRANULOSA AL MEDIO TCM199 SOBRE LA TASA DE MADURACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS EQUINOS. Sepúlveda, J.; Silva, M. & Berland, M.

EVALUACIÓN DE LA INTEGRIDAD DE MEMBRANA ESPERMÁTICA EN SEMEN CANINO DILUÍDO Y REFRIGERADO. Cartagena, A.; Sánchez, A. & Berland, M.

ALFA GLUCOSIDASA ÁCIDA Y NEUTRA EN PLASMA SEMINAL HUMANO. I.-IMPORTANCIA DE SU EVALUACIÓN EN EL PACIENTE ANDROLÓGICO. Cerda, C.; Aguilera, I.; Peña-Rehbein, P.; Miska, W.; Sánchez, R. &Peña, P.

Creative Commons License All the contents of this journal, except where otherwise noted, is licensed under a Creative Commons Attribution License