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International Journal of Morphology

On-line version ISSN 0717-9502

Int. J. Morphol. vol.21 no.3 Temuco  2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-95022003000300004 

Int. J. Morphol., 21(3):205-209, 2003.

TRANSCRIPTOS DE FUSIÓN DEL GEN BCR/ABL
EN PACIENTES CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA

FUSION TRANSCRIPTS OF BCR/ABL GENE IN
PATIENTES WITH CHRONIC MYELOID LEUKEMIA
*Carmen Gloria Artigas; **Angélica Melo; **Juan Carlos Roa; **Iván Roa;
*Ingrid Quijada; *Cecilia Vittini; ***María Elena Cabrera & ****Concepción Risueño.

ARTIGAS, C. G.; MELO, A.; ROA, J. C.; ROA, I.; QUIJADA, I.; VITTINI, C.; CABRERA, M. E. & RISUEÑO, C. Transcriptos de fusión del gen BCR-ABL en pacientes con leucemia mieloide crónica. Int. J. Morphol., 21(3):205-209, 2003.

RESUMEN: La anormalidad citogenética más común en la leucemia mieloide crónica (LMC) es el cromosoma Philadelphia, producida por la t(9;22), cuya expresión molecular es el gen de fusión BCR-ABL, que codifica proteínas con actividad tirosinquinasa. Según el punto de ruptura de los genes BCR o ABL se produce una proteína de fusión de 210-kD(p210) o 190-kD(p190). La presencia de este gen de fusión en pacientes con LMC tiene implicancia diagnóstica. Con el propósito de detectar transcriptos de fusión del gen BCR/ABL en pacientes con leucemia mieloide crónica, procedentes de la IX Región de Chile, se estudiaron 14 muestras de sangre de 11 pacientes con LMC. A 2 de ellos, se les realizó seguimiento durante su tratamiento con Gleevec. Se aplicó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR), usando una PCR en nido. Para la detección de los transcriptos de fusión p210 y p190 del gen BCR/ABL, se utilizaron 4 pares de iniciadores. En 9/14 muestras se detectó el transcripto de fusión p210 y en 5/14 los transcriptos de fusión p210 y p190. En los 2 pacientes en seguimiento, hubo desaparición del transcripto p190, permaneciendo el transcripto p210. Estos resultados reafirman la importancia de detectar transcriptos de fusión BCR/ABL para el diagnóstico y seguimiento durante el tratamiento de la LMC.

PALABRAS CLAVE: 1. BCR/ABL; 2. RT-PCR; 3. Leucemia mieloide crónica; 4. Chile. 


INTRODUCCIÓN

El cromosoma Philadelphia, descrito por Nowell y Hungerford en 1960 (Nowell & Hungerford, 1960), es la anormalidad citogenética más común observada en leucemias. Esta anormalidad cromosómica es originada por una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22 t(9;22)(q34;q11) (Rowley, 1973).

En el cromososma 22 se encuentra la región bcr (breakpoint cluster region), denominada también gen BCR, en el cual se puede distinguir la región mayor (M-bcr) entre los exones 12 al 16, (originalmente descritos como exones b1-b5), la región menor (m-bcr) ubicada entre los exones e2' y e2 y la micro región (u-bcr) ubicada en el exon 19 (Heisterkamp et al., 1985; Deininger et al., 2000; Laurent et al., 2001).

Cuando una parte del gen ABL (Abelson) localizado en el cromosoma 9, es transferida e insertada dentro del gen BCR se origina el gen de fusión BCR-ABL. Los puntos de rupturas más frecuentes en el gen BCR ocurren en los exones: 1(e1), 12(b2), 13(b3) y 19(e19) y el punto de ruptura en el gen ABL habitualmente se produce en el exon 2(a2), generando los reordenamientos e1a2, b2a2 o b3a2 y el e19a2. Los productos de estos reordenamientos corresponden a proteínas de fusión de 190 kd (p190BCR-ABL), de 210 kd (p210BCR-ABL) y de 230 kd (p230BCR-ABL), asociadas principalmente a la LLA, LMC y LMC neutrófila, respectivamente (Deininger et al. y Pane et al., 1996).

Normalmente, el gen ABL codifica una proteína de 145 kd, con actividad tirosinquinasa, que juega un rol crítico en el control y proliferación celular. Además, se le ha asociado un rol en la respuesta celular al estrés genotóxico. En cambio las proteínas generadas del gen de fusión BCR-ABL tienen actividad tirosinaquinasa aumentada, lo que favorece la proliferación neoplásica de las células hematopoyéticas a nivel de células primitivas pluripotenciales (Lisker, 1996; Sánchez-García & Grütz, 1995 y Cobaleda et al., 2000). El gen de fusión BCR-ABL está presente en más del 95% de las LMC y su detección tiene importancia diagnóstica (Lisker y Faderl et al., 1999). Esta descrito que el gen de fusión BCR-ABL se negativiza con terapias prolongadas de Interferón alfa (Eren et al., 2000) y con el tratamiento con Gleevec (STI 571) con el cual se han logrado respuestas clínicas en un alto porcentaje de los pacientes, especialmente, en las fases crónica y acelerada (Kawaguchi et al., 2001).

Durante varias décadas, la detección y estudio de anormalidades citogenéticas se ha realizado mediante el análisis o mapeo cromosómico. Actualmente, técnicas de biología molecular basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han permitido identificar más de 50 translocaciones cromosómicas, muchas de las cuales han demostrado ser específicas para distintos subtipos de leucemias.

Una de las técnicas más usadas es la PCR con transcripción reversa (RT-PCR), mediante la cual a partir de secuencias del ARN mensajero es posible detectar transcriptos de fusión del gen BCR-ABL e identificar diferentes reordenamientos según el punto de ruptura dentro del gen BCR, con mayor sensibilidad y especificidad que con el estudio citogenético (Cross, 1996 y Artigas et al., 2002).

Dada la escasa información existente en nuestro medio, en el presente trabajo nos propusimos detectar transcriptos de fusión del gen BCR/ABL, en pacientes con leucemia mieloide crónica, procedentes de la IX Región, Chile.

MATERIAL Y MÉTODO

Se estudiaron 14 muestras de sangre de 11 pacientes, entre 29 a 71 años (promedio 48,6 años), con diagnóstico de LMC. Todos procedían de la Unidad de Hemato-Oncología del Hospital Temuco. Las muestras fueron obtenidas previo consentimiento informado del paciente o de un familiar cercano. El presente estudio fue aprobado de acuerdo a la Declaración de Helsinski, por el Comité de Ética del Hospital Regional de Temuco.

La mayoría de los pacientes con LMC fueron estudiados al momento del diagnóstico, 3 de ellos fueron estudiados durante el tratamiento y a 2 de los pacientes positivos al diagnóstico, se les realizó seguimiento durante su tratamiento con Gleevec (a uno de ellos en 2 oportunidades).

Las muestras se recolectaron con anticoagulante EDTA, separando los leucocitos con una solución de Lymphoprep (Nycomed Pharma Norway). El concentrado de leucocitos se almacenó en isotiocianato de guanidina a ­70C hasta la extracción de ARN, la cual se realizó según el método de Chomczynski (Chomczynski & Sacchi, 1987).

Se utilizó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR). Mediante el uso de la enzima transcriptasa reversa, M-MLV (Gibco), se obtuvo una copia del ADN. Para comprobar el procedimiento de la RT se utilizó como control interno un PCR simple, empleando un par de iniciadores dirigidos al gen DRB1 (Artigas & Melo, 2000). Posteriormente, se realizó una PCR en nido con 30 y 35 ciclos y 64C de temperatura de hibridación, usando 6 iniciadores que amplifican segmentos génicos de los transcriptos de fusión los cuales codifican las proteínas p210BCR-ABL y p190BCR-ABL (13), con un tamaño de 456 y 444 pb, respectivamente (Figs. 1 y 2). Los segmentos amplificados fueron visualizados por electroforesis en gel de agarosa al 1.8% teñido con bromuro de etidio.


Fig. 1. Reordenamiento b3a2. Transcripto de fusión p210.
Carril 1. Marcador de ADN de 100 bp.
Carril 2. Negativo.
Carril 3. Control positivo.
Carril 4. Negativo.
Carriles 5-6. Casos positivos.
Carril 7. Control negativo.
Carril 8. Control blanco.
Las bandas representan un fragmento de 456 bp. Gel agarosa 1.8% teñido con bromuro de etidio.
Fig. 2. Reordenamiento e1a2. Transcripto de fusión p190.
Carril 1. Marcador de ADN de 100 bp.
Carriles 2-3. Casos positivos.
Carril 4. Control positivo.
Carril 5. Control negativo.
Carril 6. Control blanco.
Las bandas representan un fragmento de 444 bp. Gel agarosa 1.8% teñido con bromuro de etidio.

Como control positivo se utilizaron células leucémicas positivas para p210BCR-ABL y p190BCR-ABL. Como control negativo se utilizaron leucocitos negativos para el gen de fusión BCR-ABL. Ambos controles fueron procesados junto con las muestras.

RESULTADOS

El gen de fusión BCR-ABL fue detectado, en los 11 pacientes con LMC. Las características de los casos estudiados se muestran en la Tabla I.

Los 2 pacientes en tratamiento con Hidroxiurea, presentaron positividad del transcripto p210BCR-ABL y p190BCR-ABL. Ambos pacientes habían recibido 9 meses de tratamiento y fueron estudiados en la fase acelerada. En el paciente 3, quien recibió tratamiento con Hidroxiurea, Busulfán e Interferón Alfa durante 8 meses previo al estudio, se detectó únicamente el transcripto p210BCR-ABL. En los 2 pacientes, a quienes se les administró Gleevec, se detectó el p210BCR-ABL.

Tabla I. Características y resultados de los pacientes con LMC estudiados.


N Caso Fase de LMC
Edad/Sexo
Tratamiento
Transcripto de fusiónBCR-ABL
Reordenamiento
   
 
M-bcr
m-bcr

1 acelerada
42/M
Hidroxiurea
p210 + p190
b3a2
e1a2
2 acelerada
56/M
Hidroxiurea
p210 + p190
b3a2
e1a2
3 crisis blástica
29/F
Hidroxiurea
   
Bulsufán00
p2100000000
b3a2
   
Interferon a
4 Crónica
34/M
No
p210000000
b3a2
5 Crónica
37/M
No
p2100000000
b3a2
6 Crónica
043/M *
No
p210 + p190
b3a2
e1a2
7 Crónica
059/F k
No
p210 + p190
b3a2
e1a2
8 Crónica
48/M
No
p210 + p190
b3a2
e1a2
9 Crónica
71/M
No
p210000000
b3a2
10 Crónica
56/M
No
p210000000
b3a2
11 Crónica
60/M
No
p210000000
b3a2
12 1 mes tratamiento
043/M*
Gleevec
p210000000
b3a2
13 2 meses tratamiento
043/M*
Gleevec
p210000000
b3a2
14 1 mes tratamiento
059/F k
Gleevec
p210000000
b3a2

* Paciente estudiado al diagnóstico y en 2 oportunidades durante su tratamiento con Gleevec.
k Paciente estudiado al diagnóstico y durante su tratamiento con Gleevec.

DISCUSIÓN

En nuestro grupo de LMC encontramos positividad del transcripto de fusión p210BCR-ABL en los 11 pacientes analizados, mostrando co-expresión de p210BCR-ABL y p190BCR-ABL , 2 pacientes en fase acelerada y 3 pacientes en fase crónica. La presencia de la co-expresión de p210BCR-ABL y p190BCR-ABL es explicada como consecuencia de un evento alternativo o missplicing en el gen BCR. Aunque este hecho de co-expresión sólo ha sido detectado mediante RT-PCR en casos esporádicos de LMC en crisis blástica, estos resultados podrían hacernos pensar que en nuestra población de LMC, la co-expresión de p210BCR-ABL y p190BCR-ABL sería un hallazgo más frecuente, que lo referido en la literatura.

Se ha observado que el tipo de quimioterapia empleado, afecta la expresión de p210BCR-ABL y p190BCR-ABL. El uso de terapia convencional no negativiza la detección del gen de fusión BRC-ABL (Osorio & Muñoz, 1997), lo cual explicaría por qué los pacientes 1 y 2 (tratados con Hidroxiurea), continuaban expresando p210BCR-ABL y p190BCR-ABL durante su tratamiento. Por otro lado, utilizando la técnica RT-PCR, se ha detectado que el gen de fusión BRC-ABL se negativiza en los pacientes que están bajo terapia prolongada con Interferón alfa (Eren et al.). A nuestro paciente con LMC en crisis blástica sólo le detectamos p210BCR-ABL y no p190BCR-ABL,(como podría esperarse por estar cursando una crisis blástica). Este hecho de no detección de p190BCR-ABL podría explicarse por una baja carga tumoral o por haber recibido este paciente terapia con Interferón alfa durante un tiempo, lo cual no fue suficiente para negativizar la presencia de p210BCR-ABL. De igual modo, aunque el seguimiento de nuestros pacientes tratados con Gleevec ha sido por breve tiempo, esto podría explicar la desaparición del transcripto p190BCR-ABL permaneciendo detectable el transcripto p210BCR-ABL.

En conclusión, consideramos fundamental realizar la detección de p210BCR-ABL y p190BCR-ABL en los pacientes con LMC para confirmar el diagnóstico. La detección de transcriptos del gen de fusión BCR-ABL, aporta relevante información que permite diseñar estrategias de tratamiento apropiadas, incluido el transplante de médula ósea y el recién incorporado tratamiento con Gleevec en la LMC.


ARTIGAS, C. G.; MELO, A.; ROA, J. C.; ROA, I.; QUIJADA, I.; VITTINI, C.; CABRERA, M. E. & RISUEÑO, C. Transcriptos de fusión del gen BCR-ABL en pacientes con leucemia mieloide crónica. Int. J. Morphol., 21(3):205-209, 2003.

SUMMARY: The most frequent cytogenetic aberration in the chronic myeloid leukemia (CML) is the Philadelphia chromosome, which is produced by the translocation t(9;22), molecular expression of BCR-ABL fusion gene, encodes a protein tyrosine kinase activity. Two different fusion proteins are produced depending on the breakpoint 210-kD (p210) and 190-kD (p190). The detection of this gene in the CML has diagnostic importance.

Our goal was to detect fusion transcripts in patients with CML from the IX region of Chile. We studied 14 samples of blood from 11 patients with CML. Two of these patients were treated with Gleevec. The BCR-ABL gene was detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). We found p210 fusion transcripts in 9/14 samples and p210 and p190 co-expression in 5/14. In two patients with Gleevec treatment, disappeared p190 transcript and remained p210 transcript. Our results reaffirm the importance of BCR-ABL fusion transcripts detection for diagnostic and following CML treatment.

KEY WORDS: 1. BCR-ABL; 2. RT-PCR; 3. Chronic myeloid leukemia; 4. Chile.


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Dirección para correspondencia:
Prof. T. M. Carmen Gloria Artigas A.
Depto. de Medicina Interna
Facultad de Medicina
Universidad de La Frontera
Casilla 54-D
Temuco - CHILE

Email: cgartiga@ufro.cl

Recibido : 11-06-2003
Aceptado : 14-07-2003


* Depto. de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Temuco, Chile.
** Depto. de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.
*** Dpto. Medicina Interna, Sección Hematología Hospital del Salvador. Universidad de Chile, Santiago, Chile.
**** Dpto. Hematología-Oncología, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile.

Proyectos DIUFRO N 2121 y 9922, Universidad de La Frontera, Chile.

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