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International Journal of Morphology

versión On-line ISSN 0717-9502

Int. J. Morphol. v.28 n.3 Temuco sep. 2010

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-95022010000300018 

Int. J. Morphol.,28(3):771-775, 2010.

 

Análisis Morfométrico del Efecto de Estimulaciones de Láser Infrarrojo sobre Núcleos de Hepatocitos de Rata

 

Morphometric Analysis of the Effect of Infrared Laser Stimulation on Hepatocyte Nuclei in Rats

 

Ricardo Cornejo Uribe; Fernando Matamala Vargas; Héctor Silva Mella; Orlando Garrido Oñate; Kurt Buchegger Mena & Armin Jarpa Hidalgo

Departamento de Ciencias Básicas. Facultad de Medicina. Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

Dirección para correspondencia:


RESUMEN: De ratas Sprague Dawley tanto normales como irradiadas con dosis diarias de 1, 2, 4, 8, y 16 J/cm2 durante 15 días emitidas por el láser AsGa equivalente a 904 nm previamente anestesiadas, fueron quirúrgicamente obtenidas muestras de hígado, las que posteriormente fueron procesadas para microscopía óptica, siendo estudiadas y sometidas a técnicas morfométricas utilizando aumentos de 1000X, con especial énfasis en cuantificar áreas de núcleos y nucleolos. El análisis de los resultados entre hepatocitos normales e irradiados revela que existen marcadas diferencias entre sus áreas tanto nucleares como nucleolares, concluyéndose que los efectos de estas dosis de radiación infrarroja provoca en los hepatocitos una drástica transformación en sus componentes y por ende en su funcionalidad, principalmente en la relativa a la síntesis proteica, representando el efecto de estas estimulaciones sobre este tipo celular de elevado metabolismo.

PALABRAS CLAVE: Láser infrarrojo; Hepatocitos; Morfometría.


SUMMARY: Liver samples were taken from previously anaesthetised Sprague Dawley rats, both normal and irradiated with daily doses of 1, 2, 4, 8, and 16 J/cm2 applied over 15 days by AsGa laser equivalent to 904 nm. These samples were then processed for optical microscopy. They were studied and subjected to morphometric techniques using 1000X magnification, placing special emphasis on the quantification of the areas of nuclei and nucleoli. An analytic comparison of the results between normal and irradiated hepatocytes reveals the existence of significant differences between both the nuclear and nucleolar areas studied, from which it is concluded that the effect of these doses of infrared radiation is to provoke a drastic transformation in the components of the hepatocytes, and therefore in their functioning, principally with respect to protein synthesis, and that this would be the effect of stimulation of this nature on this type of high-metabolism cell.

KEY WORDS: Infrared laser; Hepatocytes; Morphometry.


 

INTRODUCCIÓN

El uso de las emisiones infrarrojas generadas por el diodo láser Arsenurio de Galio,se ha constituido en un método habitual en pro de obtener un sostenido alivio de una amplia gama de lesiones y afecciones articulares basado en su eficaz acción analgésica (Cetiner et al., 2006; Fikackova et al., 2007), antiinflamatoria (Fikackova et al., 2006) y cicatrizante (Kreisler et al., 2003; De Castro et al., 2001), mientras que a nivel celular induce una acentuada síntesis proteica (Simoes et al., 2009), de DNA (Pourzarandian et al., 2005), de ATP mitocondrial (Mochizuki-Oda et al., 2002; Oron et al., 2007) y de colágeno (Gomez-Villamandos et al., 1995; Cornejo et al., 2009a) como así mismo modulando la proliferación celular (Vinck et al., 2003; Mirzaei et al., 2007) las concentraciones de calcio citosólico (Mirodzhov et al., 1991; Smith et al., 2001) y la actividad de variadas enzimas (Cieslar et al., 1995; Kao & Sheen 2003).

Sin embargo, en este contexto, el resultado de los efectos subcelulares de estas estimulaciones son escasas y poco descriptivas, además considerando que el estudio de la Biología Celular nos muestra que en medida que las células son estimuladas, sus componentes sufren modificaciones cualitativas, cuantitativas y topográficas, podría suponerse que mediante un análisis cuantitativo de placas histológicas y concordante con datos obtenidos de análisis morfométricos ultraestructurales revelara como los cambios morfológicos en estructuras nucleares se traducen en función celular, básicamente relacionada con síntesis proteica, en este modelo biológico (Junqueira & Salles, 1975).

Por lo expuesto anteriormente, pareció importante precisar el rol ejercido por estimulaciones emitidas por el láser infrarrojo describiendo las respuestas celulares a nivel óptico y ultraestructural, relacionando estructuras nucleares con componentes asociados a síntesis proteica en hepatocitos de ratas irradiados con dosis infrarrojas crecientes por espacio de 15 días consecutivos, y verificar si las modificaciones que se efectúan conllevan a una alteración en su expresión génica.

MATERIAL Y MÉTODO

A partir del hígado de ratas normales, irradiados mediante láser infrarrojo con dosis de 1, 2, 4, 8 y 16 Joules/cm2 durante 15 días consecutivos, fueron obtenidas muestras las que se fijaron en formalina al 10% y posteriormente deshidratadas en batería creciente de alcoholes de 50 a 100%, por 2 horas, para posteriormente, ser incluidas en Paraplast durante una noche. Se realizaron cortes seriados de 7 µm de espesor, fijándose a portaobjetos albuminizados y dejando secar por 24 horas. El proceso de tinción requirió desparafinar con xilol por 40 minutos y proceder a la tinción nuclear mediante hematoxilina por 3 minutos y tinción citoplasmática con eosina por 5 minutos. Luego de un lavado con agua se deshidrataron los cortes con batería creciente de alcoholes otorgándoles transparencia mediante xilol fenicado por 5 minutos. Finalmente, se realizó el montaje de los cortes en medio Permount, dejando secar por 24 horas a temperatura ambiente.

Se obtuvieron micrografías ópticas de hepatocitos con aumento de hasta 1000 X en un microscopio óptico asociado a una cámara de captura de imagen, modelo Moticam 2000, Motic 2.0 Megapixeles. Para el cálculo de áreas nucleares y nucleolares se utilizó el software Motic Images Plus ML, versión 2.0

RESULTADOS

Las estimulaciones con láser infrarrojo sobre hepatocitos de rata con dosis correspondiente a: 1, 2, 4, 8 y 16 Joules/cm2 en comparación con hepatocitos normales, evidenciadas en la Figura 1, generan los siguientes datos morfométricos en relación a estructuras nucleares asociadas a síntesis proteica, analizadas en este estudio mediante microscopía óptica:

Se evidencia una directa relación entre dosis crecientes de láser infrarrojo asociado a una sostenida disminución en el área nuclear, y de igual manera se observa una relación directa entre el aumento de dosis infrarrojas con un evidente aumento de las áreas nucleolares, ambas observaciones logradas con una irradiación máxima de 8 J/cm2. Situación que se muestra en la Tabla I.


Fig. 1. Micrografias ópticas de hepatocitos de rata.
A. Normales, B. Irradiados
con dosis de 2 J/cm2, C.
Irradiados con 4 J/cm2, D.- irradiados
con 8 J/cm2. 1.000X.

Entre estimulaciones infrarrojas de 4 y 8 J/cm2, se visualiza la mayor actividad celular de hepatocitos irradiados, datos que son refrendados con el aumento de las fracciones volumétricas obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión correspondiente a retículo endoplásmico rugoso, mitocondrias y disminución de los gránulos de glicógeno, además de un 90% correspondiente a eucromatina (Cornejo et al., 2009b) (Fig. 2).

Fig. 2. Fracciones volumétricas (%) de R.E.R., Mitocondrias y
licógenoevaluados en hepatocitos de rata normales
e
irradiados con láser infrarrojo
de 4 y 8 Joules/cm2.

En hepatocitos irradiados con dosis infrarrojas superiores a 8 J/cm2, se observan notables modificaciones de las estructuras nucleares asociadas a síntesis proteica, manifestadas en un aumento del área nuclear y una disminución del área nucleolar, mientras que a nivel citosólico se visualiza disminución de las fracciones volumétricas de retículo endoplásmico rugoso y un aumento de lasde glicógeno, todo lo cual se traduciría en una evidente inhibición de la actividad celular generada por estas estimulaciones infrarrojas elevadas.

DISCUSIÓN

Producto del análisis de los resultados se evidencia que el efecto de estimulaciones crecientes con láser infrarrojo sobre hepatocitos de rata, generan una progresiva disminución del área nuclear y de igual modo, un sostenido aumento de las áreas nucleolares, ambas situaciones determinarían cambios en la morfología, ultraestructura y funcionalidad, tanto a nivel nuclear como en la actividad citosólica.

Estas modificaciones anteriormente descritas se generarían, entre otros mecanismos, producto de una activa transcripción sintetizando diversos tipos de ácido ribonucleico (ARN). De igual manera, el constante aumento de las áreas nucleolares es debido, sin duda, a un incremento en la tasa de síntesis de ARN ribosomal. Estos hallazgos, producto de estimulaciones infrarrojas semejantes a las utilizadas son coincidentes a los descritos por Baibekov et al. (1992) visualizando incremento en los volúmenes nucleolares; Marques et al. (2004) donde los fibroblastos estudiados generan crecientes nucléolos; Koutna et al. (2003) comunicando activa síntesis de RNA.

En este mismo contexto, es decir, con estimulación correspondientes a 8 J/cm2, se observa con claridad que las fracciones volumétricas de eucromatina corresponde a 90%,valor óptimo que indicaría que la expresión génica y la síntesis proteica es mayor que la efectuada tanto en el hepatocito normal, como en los estimulados con dosis menores (Cornejo et al., 2009b).

Por otro lado, es posible visualizar que el mayor desarrollo de componentes celulares, básicamente los involucrados en síntesis proteica: retículo endoplásmico rugoso (RER) y mitocondrias, es producto de las estimulaciones generadas con dosis entre 4 y 8 J/cm2. Paralelamente es preciso considerar que los volúmenes de glicógeno disminuyen con dosis crecientes de láser indicando una constante degradación de glucosas citoplasmáticas para realizar procesos de glicólisis y posterior síntesis de ATP mitocondrial, obteniendo la energía necesaria para la correspondiente síntesis de proteínas Estos resultados son semejantes a los enunciados por Kao & Sheen quienes demostraron que estas estimulaciones infrarrojas generan en hepatocitos de rata un notable incremento en la síntesis proteica, especialmente de glutatión.

Estos resultados aquí presentados definen que las dosis de emisiones infrarrojas entre 4 y 8 J/cm2 son bené ficas proclive a estimular el desarrollo de estructuras nucleares y citosólicas asociadas a síntesis proteica, y que, por el contrario, dosis mayores como 16 J/cm2 generan disminución de constituyentes nucleares y citoplasmáticos, y por ende disminuyen la actividad celular, en este sistema biológico, hallazgos absolutamente coincidentes con los demostrados tanto por Hawkins & Abrahamse (2007) como Houreld & Abrahamse (2007) quienes demuestran que en fibroblastos estimulados con dosis entre 2.5 y 5 J/cm2 se produce un notable incremento tanto en la migración como en la proliferación de estas células y de igual modo, con dosis equivalente a 16 J/cm2 se reduce la migración y proliferación llevando a un estado de stress celular, disminuyendo igualmente la síntesis de ATP y la viabilidad celular.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo es el resultado de las actividades de investigación realizadas en el proyecto DI-UFRO 08-0022, Universidad de La Frontera, Chile.

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Dirección para correspondencia:

Prof. Dr. Ricardo Cornejo Uribe
Facultad de Medicina
Universidad de La Frontera
Casilla 54-D, Temuco
CHILE

Email: rcornejo@ufro.cl

Recibido : 22-04-2010
Aceptado: 17-06-2010

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