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International Journal of Morphology

versión On-line ISSN 0717-9502

Int. J. Morphol. vol.31 no.1 Temuco mar. 2013

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-95022013000100036 

Int. J. Morphol., 31(1):217-224, 2013.

 

Criopreservación de Espermatozoides Caninos a - 80C

 

Cryopreservation of Canine Spermatozoa at -80C

 

Paulo Salinas*,**; Raúl Sánchez*,*** & Jennie Risopatrón*,****

* Centro de Biotecnología en Reproducción (BIOREN-CEBIOR), Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

** Laboratorio de Anatomía Veterinaria, Escuela de Medicina Veterinaria, Facultad de Recursos Naturales y Medicina Veterinaria, Universidad Santo Tomás, Temuco, Chile.

*** Departamento de Ciencias Preclínicas, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

**** Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

Dirección para correspondecia:


RESUMEN. La congelación y almacenamiento en nitrógeno líquido (N2L) es la técnica más utilizada para preservar el semen de canino y de otras especies domésticas durante largos períodos de tiempo. Este estudio fue diseñado para validar el uso del ultracongelador de -80C para congelar y almacenar semen canino en pajuelas. Tres protocolos fueron ensayados (n=10): Control: semen congelado y almacenado en N2L; Exp. 1: semen congelado y almacenado -80C, y Exp.2: semen congelado a -80C y almacenado en N2L. Postdescongelación se evaluó por citometría de flujo la viabilidad e integridad de membrana plasmática (SYBR-14/PI), potencial de membrana mitocondrial (DYm; JC-1), integridad de la membrana del acrosoma (PSA/FITC­PI), translocación de fosfatidilserina (Annexin-V-FITC/PI) y fragmentación del ADN (TUNEL). No se observaron diferencias significativas (P<0,05) entre los grupos Control, Exp.1 y Exp.2 respecto a: integridad de membrana plasmática intacta (42,2 ± 5,3; 35,57 ± 10,3 y 40,76 ± 12,1; respectivamente), DYm normal (54,7 ± 20,6; 44,4 ± 15,8 y 43,4 ± 15,3 respectivamente), membrana acrosomal intacta (42,9 ± 11,1; 53,2 ± 15,8 y 48,7 ± 20,1 respectivamente) y ADN fragmentado (0,87 ± 0,41; 0,75 ± 0,16; 0,79 ± 0,27 respectivamente). Sin embargo, el promedio de la motilidad progresiva postdescongelación de los grupos E1 y E2 (37,0 ± 4,4%; 36,8 ± 4,1% respectivamente) demostraron diferencias (P<0,05) respecto al grupo Control (55,9 ± 8,7%). Los resultados obtenidos en el presente estudio demostraron que la utilización del ultracongelador de -80C para congelar y almacenar espermatozoides caninos tiene un uso potencial en medicina veterinaria como alternativa a la utilización del N2L.

PALABRAS CLAVE: Canino; Espermatozoide; Congelación; Ultracongelador de -80C.


SUMMARY: The freezing and storage in liquid nitrogen (LN2) is the technique used most for the preservation of canine and other domestic species semen, for long periods of time. This study was designed to validate the use of deep freezer at -80C to freeze and store canine semen in straws. Three protocols were tested (n = 10): Control: sperm frozen in N2L and stored; Exp 1: sperm frozen and stored -80°C, and Exp.2: semen frozen at -80 ° C and stored in N2L. Post-thawing was assessed by flow cytometry and the viability of plasma membrane integrity (SYBR-14/PI), mitochondrial membrane potential (YDm, JC-1), acrosome membrane integrity (PSA / FITC-PI), translocation of phosphatidylserine (Annexin -V-FITC/PI) and DNA fragmentation (TUNEL). No significant differences (P <0.05) between the Control, Exp.2 and Exp.1groups regarding: intact plasma membrane integrity (42.2 ± 5.3, 35.57 ± 10.3 and 40.76 ± 12.1, respectively), YDm normal (54.7 ± 20.6, 44.4 ± 15.8 and 43.4 ± 15.3, respectively), intact acrosomal membrane integrity (42.9 ± 11 , 1, 53.2 ± 15.8 and 48.7 ± 20.1, respectively) and fragmented DNA (0.87 ± 0.41, 0.75 ± 0.16, 0.79 ± 0.27, respectively). However, the average motility of the post-thawing of Exp.1 and Exp.2 groups (37.0 ± 4.4% 36.8 ± 4.1% respectively) showed significant differences (P <0.05) than the Control group (55.9 ± 8.7%). The results obtained in this study showed that the use of deep freezer at -80°C for freezing and storing canine sperm has potential use in veterinary medicine as an alternative to the use of N2L.

KEY WORDS: Canine; Sperm freezing; Ultrafreezer at -80C.


 

INTRODUCCIÓN

En caninos, la congelación y conservación de espermatozoides por periodos prolongados de tiempo se realiza en nitrógeno líquido (N2L) (Alamo et al., 2005). Además, han sido utilizadas técnicas alternativas para el procedimiento de congelación como el hielo seco y ultra-congeladores programables para conservar muestras de semen, sin embargo el almacenamiento es en N2L (Olar et al., 1989; Hay et al., 1997; Thomas et al., 1993).

Ha sido determinada la función espermática en ultracongeladores de -152C utilizando parámetros como la motilidad, reacción del acrosoma y morfoanomalías (Álamo et al.; Batista et al., 2006). Sin embargo, no existen antecedentes de la utilización del ultracongelador de -80C, para congelar semen canino en pajuelas convencionales por periodos cortos como alternativa a la técnica convencional de congelación en N2L. En este estudio se evalúa el efecto de la temperatura de congelación y almacenamiento a -80C, en comparación al método convencional de congelación y almacenamiento en N2L, sobre parámetros esenciales de la función del espermatozoide de canino, tales como motilidad progresiva, funcionalidad de membranas (plasmática, acrosomal y mitocondrial) y fragmentación del ADN.

MATERIAL Y MÉTODO

Animales. Se utilizaron tres machos caninos clínicamente sanos (1 Labrador Retriever, 1 Golden Retriever y 1 mestizo) de 20 ­ 25 kg, con edades que fluctuaron entre los 3 y 5 años, pertenecientes al Centro de Biotecnología en Reproducción (CEBIOR), Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. Los caninos fueron manteni dos con una dieta balanceada y agua ad-libitum. La condición sanitaria fue evaluada periódicamente por un médico veterinario. Los animales fueron entrenados previamente como donantes y utilizados rutinariamente como donantes de semen. Para colectar los eyaculados, los caninos permanecieron un período mínimo de abstinencia de 3 días (Linde-Forsberg, 1995).

Obtención de los eyaculados. Para cada ensayo experimental (n=10), el semen fue colectado una vez por semana por manipulación digital en tubos graduados previamente temperados. Solo se colectó la segunda fracción del eyaculado rica en espermatozoides (Kutzler, 2005). Inmediatamente después de la colecta, se realizó la evaluación espermática de la motilidad, concentración por microscopía óptica y funcionabilidad de las membranas espermáticas por citometría de flujo, para asegurar una adecuada calidad seminal (Cheuquemán et al., 2012) como se describe más adelante en el texto (evaluación espermática). Solo eyaculados que presentaron un volumen de segunda fracción > a 1,5 ml, motilidad progresiva >70%, una concentración > a 200 x 106 espermatozoides/ml y viabilidad >80% fueron incluidos en este estudio. Alícuotas de similar concentración fueron mezcladas para obtener un pool de semen (n=10) con el propósito de aumentar el volumen y eliminar la variabilidad entre las muestras (Rijsselaere et al., 2002; Verstegen et al., 2005).

Dilución y congelación del semen. En cada ensayo experimental, el pool de semen fue centrifugado a 300 x g por 5 min, el plasma seminal eliminado y el pellet diluido en el medio Tris (Tris buffer­glucosa; Peña et al., 2001) y nuevamente centrifugado en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. El sobrenadante fue descartado y el pellet diluido en Extender 1 (Shäffer-Somi et al., 2006; Medio Tris suplementado con 20% [v/v] de yema de huevo y 3% [v/v], glicerol en medio Tris [pH 6.53, 740 mOsm]) para obtener una concentración ajustada de 200 x 106 espermatozoides/ml a temperatura ambiente. El semen diluido fue equilibrado a 4C durante 1 h. Después de este periodo, el semen fue rediluido (1:1, v/v) en Extender 2 (Shäffer-Somi et al.; Medio Tris suplementado con 20% [v/v] yema de huevo, 5% [v/v] glicerol y 0,5% [v/v] de Equex STM paste [Nova Chemical Sales, Scituate, MA, USA] [pH 6.4; 1370 mOsm])obteniéndose una concentración final de 100 x 106 espermatozoides/ml. Posteriormente, la suspensión espermática fue envasada en pajuelas de 0,5 ml y mantenidas a 4C. El tiempo estimado desde la colecta de semen hasta el paso previo a la congelación fue 80 min aproximados. Tres diferentes protocolos de congelación y almacenamiento fueron aplicados: Control: Las pajuelas fueron congeladas y almacenadas en N2L (Kim et al., 2010). Exp. 1: Las pajuelas fueron congeladas y almacenadas en el ultracongelador de -80C. Exp. 2: Las pajuelas fueron congeladas en el ultracongelador de -80C y almacenadas en N2L. Posterior a 30 d las pajuelas fueron descongeladas (Kim et al.) y ajustados a una concentración de 50 x 106 espermatozoides/ml para la evaluación de parámetros funcionales.

Evaluación de la función espermática. La función espermática fue analizada en el semen fresco y post descongelación en cada uno de los grupos. Para lo cual se tomaron alícuotas de las diferentes muestras espermáticas las que fueron lavadas (300 x g por 5 min) en medio Tris. Las suspensiones espermáticas (semen fresco y de cada grupo) fueron ajustadas con medio Tris a 2,5 x 106 espermatozoides/ml. Posteriormente, se prepararon alícuotas para las diferentes técnicas de evaluación espermática, que a continuación se detallan.

Motilidad (MOP). La valoración de la motilidad progresiva en los espermatozoides se realizó siempre por el mismo evaluador. El número de campos valorados fue un mínimo de diez, siempre en el centro de la muestra, para obtener valores objetivos. Se determinó la motilidad progresiva post descongelación utilizando 10 µl de suspensión espermática en un portaobjeto bajo microscopio óptico (Axiolab drd, KT 450905, Zeiss), con platina temperada (37C) y condensador de contraste de fases a 400x. El porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva se determinó considerando los grados 3 y 4 dentro de una escala de 0 a 4 (Risopatrón et al., 2002; 2012; Kim et al.). El promedio de las diez sucesivas estimaciones fue registrado como porcentaje de motilidad progresiva.

Viabilidad e integridad de la membrana plasmática. La viabilidad fue considerada como el porcentaje de espermatozoides vivos con membrana plasmática íntegra. Se utilizó el kit comercial SYBR-14/PI (LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit; Molecular Probes n° catálogo L7011 Eugene, OR, USA) (Rijsselaere et al., 2004). A 250 µl de suspensión espermática (2,5 x 106 espermatozoides/ml) se le adicionó 2,5 ml de SYBR-14 (10 µM en DMSO), se incubaron durante 7 min a 38C, posteriormente se adicionó 1µl de Ioduro de Propidio (PI 250 µg/ml) incubando 7 min adicionales a 38C. Los espermatozoides fueron lavados con Sp-TALP (Parrish et al., 1988), centrifugados a 300 g por 5 min y el pellet re-suspendido en 400 µl del mismo medio de lavado, para ser analizados por citometría de flujo. Los espermatozoides analizados se clasificaron como: vivos con membrana plasmática intacta (SYBR-14 +/PI -), muertos (SYBR-14 - /PI +) y moribundos (SYBR-14 + /PI +). En cada ensayo el análisis fue repetido tres veces.

Integridad de la membrana acrosomal. Se utilizó la técnica de tinción fluorescente FITC-conjugada con Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) (Kit FITC-PSA/ PI; Sigma St. Louis MO, USA) (Peña et al., 1999). A 250 µl de suspensión espermática (2,5 x 106 espermatozoides/ml) se adicionó 2,5 µl PSA-FITC (2µM de solución stock/PBS) y 5 µl de PI (250 µg/ml). La suspensión espermática fue incubada durante 15 min a 38C en oscuridad, luego se centrifugó a 300 g por 5 min, y el pellet fue re-suspendido en 400 µl de Sp-TALP para su análisis en citómetro de flujo. Los espermatozoides fueron clasificados como: vivos con acrosoma intacto (FITC-PSA- /PI-) y vivos con acrosoma dañado (FITC-PSA+/PI-). En cada ensayo el análisis fue repetido tres veces.

Potencial de membrana mitocondrial (). Se utilizó el kit comercial Mit-E-Y Mitochondrial Permeability Detection Kit (BIOMOL® Research Laboratories, AK-116). Un volumen de 250 µl de suspensión espermática (2,5 x 106 espermatozoides/ml) fue centrifugado a 300 g por 5 min y descartado el sobrenadante. El pellet fue resuspendido en 250 µl de solución de trabajo (1 µl JC-1 en 500 µl TRIS), luego se incubó durante 15 min a 38 C protegido de la luz. Posteriormente, se centrifugó a 300 x g por 5 min, se eliminó el sobrenadante y el pellet de espermatozoides fue re-suspendido en 400 µl de Sp-TALP para ser analizados por citometría de flujo. Los espermatozoides con fluorescencia roja fueron considerados como población de células con normal , y los de coloración verde con un alterado. En cada ensayo el análisis fue repetido tres veces.

Integridad del ADN. Se evaluó utilizando el ensayo TUNEL (In situ Cell Death Detection Kit with fluorescein, Roche,, Mannheim, BW, Germany) descrito por Lopes et al. (1998). La integridad del ADN espermático fue evaluado por citometría de flujo al cuantificar la incorporación de dUTP marcado en los sitios de fragmentación del ADN (Cordelli et al., 2005). La suspensión espermática (3 x 106 espermatozoides/ml) fue fijada en formaldehido al 4% y permeabilizados en 0,1% Triton X-100 en 0,1% de citrato de sodio. Se agregó 50 µl de enzima TdT y dUTP conjugado con FITC y se incubó durante una hora a 37C en oscuridad. Posteriormente, se adicionó PI (3,5 µg/ml), se homogenizó suavemente y se analizó en citómetro de flujo. Se consideraron los espermatozoides viables con ADN íntegro (TUNEL -) y fragmentado (TUNEL +). En cada ensayo el análisis fue repetido tres veces.

Ultracongelador. El ultracongelador utilizado en este estudio fue un Thermo® modelo Revco ULT1386-5V. El equipo consta de un microprocesador de control de temperatura que mantiene la temperatura interna a -80C (temperatura ambiente 22C aprox.). El rango de temperatura oscila entre -40C y -86C, velocidades programables de congelación no disponible. Previo al comienzo del estudio, se determinó la curva de descenso de temperatura mediante una termocupla Digi-Sense® Type-K con una sonda termosensible introducida en el ultracongelador a la altura de las pajuelas. Se pudo comprobar una velocidad de descenso de temperatura de -10C/min desde 4C a-70C y de -0,26C/min desde los -70 C a -80C.

Citometría de Flujo. Todas las evaluaciones se realizaron mediante un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Las células fueron excitadas por un láser de argón de 488 nm. Cada análisis consistió en la adquisición de un mínimo de 10.000 espermatozoides teñidos, los cuales fueron cuantificados simultáneamente para fluorescencia verde y roja. Se evaluaron 600-1000 células/s a través del láser. De acuerdo a parámetros de granularidad relativa (Sidescatter­SSC) y tamaño relativo (Forwardscatter­ FSC) las células fueron separadas, de manera que sólo las que poseían características de dispersión de luz típicas de espermatozoides de canino fueron analizadas para fluorescencias. Además, para ajustar correctamente la región sobre los espermatozoides a evaluar y evitar los desechos o debrís celulares se utilizó la combinación de tinciones fluorescentes para identificar las células muertas, las células vivas o células con membranas dañadas. Los datos para los canales de fluorescencia verde y roja fueron obtenidos por escala logarítmica y analizados por medio de un Software Cell-Quest Pro (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).

Análisis estadístico. Los resultados fueron expresados como promedio ± DE. Se utilizó el Test de D´Agostino para detectar normalidad en los datos. El análisis estadístico entre los grupos se realizó mediante el Test de Varianza Paramétrico ANOVA de medidas repetidas. Para detectar diferencias significativas entre grupos se aplicó el Test Paramétrico de Comparación Múltiple de Tuckey. La significancia estadística para todas las pruebas fue establecida para un P < 0.05. El análisis de los datos se realizó con el software GraphPad Prism® versión 5.0 para MAC OS X (GraphPad Software, San Diego CA).

RESULTADOS

Pool de semen fresco. Presentaron las siguientes características (Promedio ± DE). La concentración espermática fue 972 x106 ± 192 x106 espermatozoides/ml. El porcentaje de MOP progresiva fue 89,0 ± 2,5. El porcentaje de espermatozoides viables con membrana plasmática intacta fue de 83,31 ± 7,67. De los espermatozoides viables, un 85,57 ± 6,2 % presentó DYM intacto, un 99,6 ± 0,04 % ADN íntegro y un 78,6 ± 5,6 % membrana acrosomal intacta.

Motilidad. La MOP en los grupos Exp. 1 y Exp. 2 (37,0 ± 4,4% y 36,8 ± 4,1%) fueron significativamente menores (P<0,0001) respecto al Control (método convencional; 55,9 ± 8,7%), Fig. 1a.

Evaluación de membranas espermáticas. El análisis por citometría de flujo en espermatozoides caninos congelados demostró que no hay diferencias estadísticas significativas entre los grupos respecto a: espermatozoides viables con membrana plasmática intacta (Control: 42,27 ± 5,29; Exp.1: 35,57 ± 10,25 y Exp.1: 40,76 ± 12,11; P:0.2303; Fig. 1b),

DYM intacto (Control: 54,66 ± 20,6; Exp.1: 44,4 ± 15,8 y Exp.2: 43,4 ± 15,33; P:0.2844, Fig. 1c), espermatozoides viables con membrana acrosomal intacta (Control: 42,95 ± 11,1; Exp. 1: 53,2± 15,8 y Exp.2: 48,7 ± 20,1; P:0,1991, Fig. 1d).

Determinación de la integridad del ADN. El análisis por citometría de flujo en espermatozoides caninos congelados demostró que no hay diferencias estadísticas significativas entre los grupos respecto a la integridad del ADN (Control: 99,13 ± 1,2; Exp1: 98,0 ± 3,4; Exp 2: 97,83 ± 2,5; P:0,6579, Fig. 1e).

DISCUSIÓN

El efecto beneficioso de la utilización de metodologías alternativas al N2L para criopreservar células espermáticas ha sido reportado previamente (Salamon, 1971; Medrano et al., 2002; Alamo et al.; Batista et al.), sin embargo, el uso de ultracongeladores no programables para congelar/almacenar semen ha sido de uso limitado (Alamo et al.; Batista et al.). No existen antecedentes previos de la utilización del ultracongelador de -80C como técnica para conservar y almacenar espermatozoides caninos, siendo este el primer estudio que evalúa esta posibilidad, analizando por citometría de flujo la función espermática.

El parámetro más elemental que determina el efecto de la congelación sobre la función espermática es la motilidad progresiva, en nuestro estudio las motilidades progresivas en el control y grupos experimentales fueron superiores a las reportadas previamente para espermatozoides congelados/descongelados de canino, utilizando el método convencional (Rota et al., 2010; Kim et al., 2010). La motilidad fue el único parámetro espermático en el cual se presentaron diferencias significativas entre la técnica convencional y los experimentales.

La congelación provoca una disminución drástica de la motilidad progresiva, como consecuencia de los procedimientos de congelación/descongelación (Watson, 2000; Benson et al., 2012). Entre las variables que influyen en la sobrevivencia de los espermatozoides criopreservados de animales domésticos en ultracongeladores, se encuentra la velocidad de congelación (Yu et al., 2002; Benson et al.). En este estudio la motilidad progresiva post descongelación con la técnica convencional, fue mayor que las obtenidas en el ultracongelador a -80C a velocidades lentas (10C/min desde 4C a -70C y -0,26C/min a -80C). No obstante, estas últimas fueron similares a las descritas por Yu et al. en un ultracongelador programable a una velocidad similar a nuestro estudio, determinando que la velocidad de congelación de -30C/min, que es la usual en la congelación con N2L, es la óptima para el semen de canino, y que velocidades más rápidas o lentas de congelación, como es el caso del ultracongelador de -80C (-10C/min) reduciría la motilidad e incrementaría el daño acrosomal (Hay et al., 1997; Watson, 1995; Peña & Linde-Forsberg, 2000). En cambio, en nuestros resultados, el daño acrosomal no fue significativamente diferente entre las técnicas de congelación evaluadas, en concordancia con Rota et al. (2005), que igualmente, no detectaron diferencias en el estado acrosomal al utilizar velocidades de enfriamiento rápidas (-50C/min) o lentas (-10C/min). Además, los espermatozoides congelados en el ultracongelador de -80C y conservadas en N2L (Exp. 2) presentaron resultados similares de motilidad a los descritos por Hori et al. (2005), quienes congelaron los espermatozoides a una velocidad de -10C/min por exposición directa al vapor de N2L hasta alcanzar una temperatura de -70C, y posteriormente fueron almacenados en N2L (-196C), observando una pérdida adicional de la motilidad post descongelación al congelar los espermatozoides a esta velocidad. Durante la congelación la formación de hielo intracelular no ocurre a -10C/min, y el porcentaje de viabilidad y MOP aumenta o se mantiene constante entre -10C/min y 0,5C/min (refleja el "efecto solución" como mecanismo dominante de injuria y no la formación de hielo intracelular) (Thirumala et al., 2003), esto concuerda con la "hipótesis de los dos factores" descrita por Mazur et al. (1972; 1984) y Benson et al.

La motilidad es el indicador más sensible del daño celular debido a la congelación, incluso más que la integridad de la membrana plasmática (Yu et al.), efecto que también ha sido observado en espermatozoides de carnero (Del Valle et al., 2010) y búfalo (Khan et al., 2009). Los resultados obtenidos en el presente estudio, concuerdan con lo sugerido por Yu et al., quien obtuvo porcentajes de MOP más bajos que los porcentajes con membrana plasmática íntegra, atribuyendo esta diferencia a cambios en el transporte activo y a la permeabilidad en la membrana plasmática de la región de la cola. Al realizar inmediatamente la evaluación espermatica post descongelación, se observan espermatozoides inmóviles que después de un periodo corto de tiempo a temperaturas de 37°C recuperan su motilidad (Yu et al.; Del Valle et al.). En el presente estudio la motilidad fue evaluada inmediatamente post descongelación y de forma subjetiva, lo que posiblemente podría explicar los bajos porcentajes.

La integridad de la membrana plasmática es un requisito para mantener la viabilidad espermática y crucial para la supervivencia del espermatozoide en el tracto reproductor de la hembra y la mantención de la capacidad fecundante (Ôura & Toshimori, 1990). Este es el primer reporte de evaluación de la viabilidad e integridad de la membrana espermática por tinción fluorescente SYBR-14/PI en espermatozoides congelados y/o almacenamiento en un ultracongelador de -80C, demostrando que no existen diferencias significativas entre los espermatozoides congelados en el ultracongelador (Exp. 1 y 2) y la congelación convencional (Control). Nuestros resultados concuerdan con Rota et al. (2005) quien evaluó la integridad de la membrana plasmática de espermatozoides caninos congelados a velocidades lentas (utilizando un ultracongelador programado para descender a -0,5C/min entre 5C y 10C, a -8C/min entre -10C y -60C y posterior almacenamiento en N2L) y velocidades rápidas (N2L) utilizando el test hiposmótico (HOS test), observando un alto porcentaje de espermatozoides con membrana plasmática funcional en las muestras congeladas en ultracongelador, sin diferencias significativas comparadas con la congelación convencional. Esto sugiere que la congelación de espermatozoides caninos a velocidades lentas ­ tales como -10C/min ­ disminuye el daño atribuido a la deshidratación celular o a la formación de hielo intracelular (Mazur, 1984). El porcentaje promedio de membrana íntegra evaluada por SYBR-14/PI en los espermatozoides congelados/descongelados por el método convencional (Control) fue superior a los grupos experimentales 1 y 2, y a lo reportado previamente por Kim et al. utilizando las tinciones 6-C-FDA/PI o HOS test. Respecto a los grupos experimentales, nuestros resultados son similares a los obtenidos por Yu et al. y Rota et al. (2005) en estudios de congelación de espermatozoides en ultracongeladores programables.

Estudios previos han demostrado que la criocon-servación afecta la función mitocondrial de los esperma-tozoides y que la diferencia de potencial de membrana mitocondrial es un indicador sensible del estado de la función de las mitocondrias (Ortega-Ferrusola et al., 2008). Al respecto, el potencial de membrana mitocondrial es posible de evaluar en forma rápida utilizando la tinción JC-1 y la citometría de flujo, y existe una relación entre el estado mitocondrial y la motilidad espermática. En el presente estudio, el porcentaje promedio de espermatozoides vivos con potencial de membrana mitocondrial intacto (JC1-negativo) sometidos al ultracongelador de -80C (Exp.1 y 2) fueron levemente inferiores a los obtenidos con el método convencional de congelación (Control), no observándose diferencias significativas entre los tratamientos (P<0,05). Concordando con Volpe et al. (2009), quien reportó poblaciones espermáticas caninas con motilidad baja que evidenciaron un potencial de membrana mitocondrial inalterado, sugiriendo que la respiración mitocondrial puede no ser suficiente para mantener la motilidad en la célula espermática, y que puede ser importante para la sobrevivencia del espermatozoide en el tracto reproductivo de la hembra. Consideramos que es importante investigar más profundamente en la especie canina la relación existente entre la motilidad y el estado mitocondrial para dilucidar la fuente energética para la motilidad espermática en esta especie.

Respecto a la integridad de la membrana acrosomal, los porcentajes promedios de los espermatozoides vivos con la membrana acrosomal intacta (FITC.PSA-/PI-) sometidos al ultracongelador de -80C (Exp.1 y 2) fueron levemente superiores a los obtenidos con el método convencional (Control), sin embargo no fueron significativamente diferentes (P<0,05). Los resultados sugieren que no existen diferencias en la mantención de la integridad de la membrana del acrosoma entre la congelación de espermatozoides mediante el método convencional y la utilización del ultracongelador de -80C (Exp. 1 y 2); los resultados concuerdan con estudios previos en caninos utilizando ultracongeladores de -152C con un promedio de 95% de espermatozoides con acrosoma íntegro sin diferencias significativas con el método convencional de congelación (Álamo et al.).

La congelación provoca daño en el ADN de espermatozoides de caninos (Rota et al., 2005; Kim et al., 2010). En este primer estudio que evalúa la integridad del ADN en espermatozoides congelados en un ultracongelador de -80C a una velocidad de -10C/min, no se encontró diferencias significativas entre los resultados de los tres protocolos ensayados. Esto sugiere, que nuestro protocolo experimental no afecto la integridad de ADN. Los porcentajes de integridad de ADN son mayores a los obtenidos por Rota et al. (2005) y Kim et al. quienes evaluaron la fragmentación de la cromatina utilizando como marcador nuclear la tinción naranja de acridina. Estudios previos en bovinos, equinos y cerdos han establecido un nivel máximo de denaturación del ADN (>30%) como indicador de incapacidad de fecundar (Evenson & Jost, 2000). Las diferencias entre especies, el procedimiento de criopreservación, la formulación de diluyentes y el tiempo de post descongelación, puede explicar las diferencias observadas entre los estudios.

Existe una variedad de investigaciones realizadas con el propósito de optimizar los procedimientos de congelación en N2L. Por los resultados obtenidos en el presente estudio, consideramos que el uso del ultracongelador no programable de -80C (-10C/min) para congelar y almacenar espermatozoides caninos tiene un uso potencial en medicina veterinaria como alternativa al N2L, lo que implica una importante reducción en el costo de almacenaje de las muestras en los bancos de semen de caninos. Este estudio, si bien, evalúa in vitro y a corto plazo la criopreservación de espermatozoides a -80C, es de interés evaluar a largo plazo e in vitro la calidad seminal, distintas concentraciones de glicerol, y la variación individual entre machos, así como la capacidad fecundante de los espermatozoides descongelados en pruebas in vitro (penetración heteróloga) o in vivo (inseminación artificial).

AGRADECIMIENTOS

Proyecto Fondecyt N 1070594 y Direcciones de Investigación de la Universidad de La Frontera Proyectos N° DI10-2019 y DI12-0089.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Dirección para correspondecia:

Paulo Salinas Pérez

Escuela de Medicina Veterinaria
Universidad Santo Tomas
Rodríguez 060, Temuco
CHILE

E-mail: psalinas@santotomas.cl

Recibido : 25-10-2012
Aceptado: 13-11-2012

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