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International Journal of Morphology

versão On-line ISSN 0717-9502

Int. J. Morphol. vol.35 no.4 Temuco dez. 2017

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-95022017000401576 

Articles

Utilidad de Tinción de Tricrómico de Masson en la Cuantificación de Densidad Media Vascular en Mucosa Oral Normal, Displasia Epitelial y Carcinoma Oral de Células Escamosas

Utility of Masson’s Trichrome Stain in the Quantification of Mean Vascular Density in Normal Oral Mucosa, Epithelial Dysplasia and Oral Squamous Cell Carcinoma

Felipe Cáceres1 

Gilberto Herrera1 

Alejandra Fernández1  3 

Javier Fernández4 

René Martínez1 

Daniela Carvajal4 

Ziyad S. Haidar2  3  5  6 

1 Departamento de Cirugía y Patología, Facultad de Odontología, Universidad Andrés Bello, Santiago, Chile.

2 Programa de Doctorado en BioMedicina, Facultad de Medicina, Universidad de los Andes, Santiago, Chile.

3 BioMAT’X, Centro de Investigación Biomédica, Universidad de los Andes, Santiago, Chile.

4 Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile.

5 Plan de Mejoramiento Institucional (PMI) en Innovación I+D+i, Universidad de los Andes, Santiago, Chile.

6 Facultad de Odontología, Universidad de los Andes, Santiago, Chile.

RESUMEN:

El objetivo de este estudio fue valuar la utilidad del uso de la tinción de Tricrómico de Masson (TM) en la cuantificación de la densidad media vascular (DMV) en Mucosa Oral Normal (MON), Displasia Epitelial Oral (DEO) y Carcinoma Oral de Células Escamosas (COCE). Estudio descriptivo de serie de casos. Se analizaron 17 muestras de MON, 15 muestras de DEO y 16 de COCE, teñidas con TM. Para determinar su utilidad, se compararon con las mismas muestras analizadas con técnica de inmunohistoquímica contra CD31. La cuantificación de la DMV se realizó en las 3 áreas de mayor vascularización de cada muestra. Se determinó la DMV según diagnóstico mediante la tinción TM e inmunohistoquímica contra CD31, y se calculó la correlación entre ambos. La DMV cuantificada con TM y contra CD31 difiere según el diagnóstico, observándose un aumento de la DMV al malignizarse el diagnóstico. No se encontraron diferencias al comparar la DMV cuantificada con TM y contra CD31. La correlación de la DMV analizado por TM y contra CD31 es significativa y moderada. La cuantificación de vasos sanguíneos es posible mediante la tinción de TM en muestras de MON, DEO y COCE, con una correlación moderada con la inmunohistoquímica contra CD31.

PALABRAS CLAVE: Células epiteliales; Neoplasias de la boca; Neovascularización patológicas

SUMMARY.

The objective of this study was to evaluate the utility of Masson's Trichrome (TM) staining in the quantification of the mean vascular density (DMV) in samples of normal oral mucosa (MON), oral epithelial dysplasia (ODE) and oral squamous cell carcinoma (COCE). The design - a descriptive study of case series. We analyzed 17 samples of MON, 15 samples of DEO and 16 samples of COCE, stained with TM. To determine usefulness, we compared and analyzed the same samples, either stained with TM or with immunohistochemical technique against CD31. Quantification of the DMV was performed in the 3 areas of greatest vascularization in each sample. DMV was determined according to diagnosis by TM staining and immunohistochemistry against CD31, and the correlation between the two was then calculated. DMV quantified with TM and against CD31 differs according to the diagnosis, with an increase in DMV upon malignant diagnosis. No differences were found when comparing DMV quantified with TM and against CD31. The correlation of the DMV analyzed by TM and against CD31 is significant and moderate. Quantification of blood vessels is possible by TM staining in samples of MON, DEO and COCE. TM staining is moderately correlated with immunohistochemistry against CD31.

KEY WORDS: Epithelial cells; Mouth neoplasms; Pathological neovascularization

INTRODUCCIÓN

La neoplasia maligna más frecuente de la cavidad oral es el carcinoma oral de células escamosas (COCE) que deriva del epitelio escamoso estratificado de la mucosa oral (Rivera & Venegas, 2014; Gupta et al., 2016). El COCE se desarrolla a partir de la transformación maligna de la mucosa oral normal (MON) o displasia epitelial oral (DEO) (Menakuru et al., 2008; Ho et al., 2012; Wang et al., 2014; Scully et al., 2014). El COCE corresponde al 95 % de las neoplasias orales y su tasa de supervivencia es de un 50 % a los 5 años (Fernández et al., 2015).

En la década de 1970 surgió el concepto de que el crecimiento de los carcinomas está asociado a la angiogénesis (Sathyakumar et al., 2012). Actualmente es conocido que en las neoplasias malignas se pierde la regulación de la angiogénesis, resultando un aumento de los factores proangiogénicos y/o la pérdida de los factores angiogénicos inhibidores (Ryan et al., 2011), en consecuencia cambiando el balance a favor de la angiogénesis tumoral (Bruno et al., 2014).

Para el análisis de los vasos sanguíneos en muestras histológicas se ha recomendado su cuantificación mediante la identificación de CD31 por técnica de inmunohistoquímica. Sullivan et al. (2015) indicaron que este marcador presenta una alta sensibilidad en la tinción de vasos (100 %). CD-31 es una proteína transmembrana o molécula de adhesión ubicada en las células endoteliales (Moriyama et al., 1997; Pujari et al., 2013; Sullivan et al.). Sin embargo, la detección contra CD31 mediante inmunohistoquímica necesita un procedimiento riguroso y altos costos. Por tal motivo, el objetivo del presente estudio es evaluar la cuantificación de vasos sanguíneos en muestras de MOD, DEO y COCE mediante tinción TM e inmunohistoquímica contra CD31y evaluar su correlación.

MATERIALES Y MÉTODO

Se diseñó un estudio descriptivo, serie de casos. El estudio fue aprobado por el comité de bioética de la Facultad de Odontología, Universidad Andrés Bello. (Nº de proyecto: PROPRGFO_002016.006_2016).

Muestra. La muestra del estudio consistió en tacos embebidos en parafina, de los cuales correspondieron a 16 casos de MON, 17 de DEO y 15 de COCE. Las muestras fueron obtenidas del registro del Servicio de Histopatología, Facultad de Odontología, Universidad Andrés Bello, entre los años 2004 y 2012. Para corroborar los diagnósticos de MON, DEO y COCE, las muestras fueron evaluadas y diagnosticadas por un patólogo oral experto, con tinción de hematoxilina eosina, considerando los criterios diagnósticos propuestos por la OMS (Barnes et al., 2005).

Criterios de inclusión y exclusión para la selección de las muestras. Los criterios de inclusión correspondieron a las muestras que contaron con diagnóstico de MON o DEO o COCE. Se excluyeron los casos con diagnóstico de DEO o COCE secundario o de metástasis.

Técnica de inmunohistoquímica para CD31. De las muestras se obtuvieron cortes de 4 micrones los que fueron montados en portaobjetos xilanizados, desparafinados e hidratados con agua destilada. Una vez hidratados, se realizó una recuperación antigénica en una vaporera utilizando buffer de citrato a pH 6. Luego se bloqueó la enzima peroxidasa endógena mediante la aplicación de peróxido de hidrógeno al 3 %. De cada bloque embebido en parafina se obtuvo un corte de tejido de 4 micrómetros de espesor, el que fue llevado a un portaobjeto cubierto con el adhesivo poli-L-Lisina (BioSB, Santa Bárbara, USA). Estas secciones fueron sometidas a reaccionar con el anticuerpo monoclonal CD-31 (DAKO) de ratones [CD31, anticuerpo monoclonal de ratones, Clon QBend/10, Isotipo Inmunoglobulina tipo G-1 (IgG1)], diluido 1:40, de localización membranosa, BioSB, Santa Bárbara USA, usando método del complejo avidina-biotina-peroxidasa, a una temperatura de 37 ºC durante 32 minutos. La recuperación antigénica se realizó a una temperatura 95-100 ºC durante 60 minutos. Cada muestra se comparó con un control positivo y negativo inserto en cada una de las placas histológicas. El control inmunopositivo correspondió a un segmento de angiosarcoma sometido a la técnica de inmunohistoquímica contra CD31. El control inmunonegativo se obtuvo mediante la omisión del anticuerpo primario.

Técnica de tinción tricrómica de Masson. De las muestras se obtuvieron cortes de 4 micrones los cuales se desparafinaron e hidrataron en agua destilada. Primero se fijó en solución de formaldehido y luego se realizó un montaje con líquido de Bouin durante 1 hora a 56-60 ºC, se enfrió y lavó en agua destilada para quitar el color amarillo. Se realizó un teñido con hematoxilina férrica durante 10 minutos y se lavó en agua destilada durante 10 minutos. Luego se realizó teñido con la solución de escarlatafucsina ácida durante 2-5 minutos y se lavó con agua destilada. A continuación, se trató con la solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotungstico durante 10-15 minutos y luego se realizó el teñido con solución de azul de anilina 15 minutos. Se lavó en agua destilada, deshidrató, aclaró y montó en un portaobjeto.

Determinación la densidad media vascular (DMV). Para el análisis de todas las muestras obtenidas, dos patólogos orales determinaron las áreas de mayor vascularización en cada una de las muestras de estudio, utilizando un microscopio óptico (Olympus® CX-31) con un aumento de 4x. Luego se cambió el objetivo a un aumento de 40x y se registraron fotográficamente 3 imágenes de manera consecutivas, utilizando una cámara digital Micrometrics® modelo 518 CU de 5,1 megapixeles incorporada al microscopio óptico. Se contaron los vasos sanguíneos identificados con tinción TM y con inmunotinción contra CD-31 mediante el programa Image J® versión. 1.6.24. Se consideraron como vasos sanguíneos a las estructuras tubulillares revestida por células endoteliales, con o sin presencia de células rojas intralobulillares. Los vasos sanguíneos con tinción TM se identificaron de color rojo y la inmunotinción contra CD31 se identificó de color café. La densidad media vascular de cada placa teñida se determinó mediante el promedio de la cantidad de vasos de 3 hot spots (HS) como indica la siguiente fórmula: DMV = (N° vasos HS 1 + N° vasos HS 2 + N° vasos HS 3) / 3.

Análisis estadístico. La variable DMV se representó mediante mediana y rango intercuartílico. El análisis de la DMV según diagnóstico se realizó mediante el test KruskalWallis y con el test post hoc de Dunn's Pairwise. La comparación de la DMV según tinción CD31 y TM se realizó mediante el test Wilcoxon signed-rank, y la correlación entre ambas según el test Spearman. Se utilizó un nivel de significancia de un 0,05 y se realizó el análisis estadístico con el programa STATA 12® (STATACORP LP, Texas, USA).

RESULTADOS

La muestra del estudio consistió en un total de 48 cortes histológicos, sus distribuciones según diagnóstico se muestran en la Tabla I. Se obtuvo una DMV mediante inmunohistoquímica CD31 en los pacientes con diagnóstico de MON de: 10 vasos con un rango intercuartílico de 3,67 vasos, en los pacientes con diagnóstico de DEO de 13,33 vasos con un rango intercuartílico de 7,3 vasos y en los pacientes con diagnóstico de COCE de 15,16 vasos con un rango intercuartílico de 18 vasos - Tabla II.

Tabla I Características de los pacientes según diagnóstico histopatológico. 

Variable Diagnostico
Mucosa oral Normal Displasia Epitelial COCE Total P
Genero 0,367
Masculino 4 (23,53%) 7 (46,67%) 7 (43,75%) 18
Femenino 13 (76,47%) 8 (53,33%) 9 (56,25%) 30
Localización 0,458
Bajo riesgo 17 (100%) 9 (60%) 12 (75%) 38
Alto riesgo 0 (0%) 6 (40%) 4 (25%) 10
Edad 0,001
<40 17 (100%) 1 (6,66%) 0 (0%) 18
40-60 0 (0%) 7 (16,67%) 1 (6,25%) 8
>60 0 (0%) 7 (16,67%) 15(93,75%) 22
TOTAL 17 (100%) 15 (100%) 16 (100%) 48

Tabla II DMV según tinción TM e inmunohistoquímica contra CD31. 

Variable Mediana Rango Intercuartilico
CD31
MON 10 3,67
DEO 13,33 7,3
COCE 15,16 18
TM
MON 5,66 4,66
DEO 14 7,34
COCE 19,16 12,67

Al analizar la DMV según diagnóstico mediante inmunohistoquímica CD31, se encontraron diferencias entre los grupos (r=0,002). La DMV de los pacientes con diagnóstico de MON difirió de los pacientes con COCE (r<0,001), al igual que entre los pacientes con diagnóstico de DEO y COCE (r=0,032), sin existir diferencias entre el grupo MON y DEO (r=0,067). (Fig.1. B, D, F, H).

De igual forma, se obtuvo la DMV mediante la tinción TM. Los pacientes con diagnóstico de MON presentaron una DMV de 5,66 vasos con un rango intercuartílico de 4,66 vasos, los pacientes con diagnóstico de DEO presentaron una DMV de 14 vasos con un rango intercuartílico de 7,34 vasos y los pacientes con diagnóstico de COCE presentaron una DMV de 19,16 vasos con un rango intercuartílico de 12,67 vasos (Tabla II). (Fig.1. A, C, E, G).

Al analizar la DMV según diagnóstico mediante tinción TM, se encontraron diferencias entre los 3 grupos diagnósticos (r<0,001). Se evidenciaron diferencias de la DMV entre el grupo MON y DEO (r<0,001) y entre MON y COCE (r<0,001). No se encontraron diferencias entre el grupo DEO y COCE (r=0,101).

Al comparar la DMV de todos los pacientes mediante la inmunohistoquímica CD31 y la tinción TM, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (r=0,719). Al evaluar el grado de correlación entre ambas, se obtuvo que esta fue significativa (r=0,001), con un grado de correlación moderado (rho de Spearman= 0,46).

Fig. 1 A. Se observa muestra de mucosa oral normal con aumento de 40x, tinción de Tricrómico de Masson. B. Se observa muestra de mucosa oral normal con aumento de 40x, inmunotinción contra CD31. C. Se observa muestra de Displasia epitelial Oral leve con aumento de 40x, tinción de Tricrómico de Masson. D. Se observa muestra de Displasia Epitelial Oral leve con aumento de 40x, inmunotinción contra CD31. E. Se observa muestra de Displasia Epitelial Oral severa con aumento de 40x, tinción de Tricrómico de Masson. F. Se observa muestra de Displasia Epitelial Oral severa con aumento de 40x, inmunotinción contra CD31. G. Se observa muestra de Carcinoma Oral de Células Escamosas moderadamente diferenciado con aumento de 40x, tinción Tricrómico de Masson. H. Se observa muestra de Carcinoma Oral de Células Escamosas moderadamente diferenciado con aumento de 40x, inmunotinción contra CD31. 

DISCUSIÓN

La angiogénesis se ha asociado a la transformación maligna del epitelio oral y a la agresividad de COCE (Michailidou et al., 2012). Es por esto que diversos investigadores han cuantificado vasos sanguíneos mediante técnica de inmunohistoquímica contra CD31, CD34, y CD105 (Cheng et al., 2014; Andisheh-Tadbir et al., 2016; Fernández et al., 2017). Es conocido que la técnica de inmuhistoquímica requiere equipamiento específico y experticia en la técnica, sumado a altos costos. Por esos motivos, el objetivo de este estudio fue encontrar una alternativa asequible que permita estudiar la angiogénesis de las lesiones potencialmente malignas y malignas, que se encuentre disponible en los diferentes centros de salud, por lo que comparamos el uso de la tinción de TM respecto a la inmunohistoquímica contra CD31, la que es considerada de elección para el estudio de vasos sanguíneos. La tinción de TM es una técnica corriente que distingue 3 colores y permite visualizar claramente las fibras de colágeno tipo I y IV, lo que facilita distinguir vasos sanguíneos con respecto a muestras analizadas por hematoxilina eosina (Pujari et al.).

En este estudio se observó que la la DMV de pacientes muestras histológicas de MON, DEO y COCE teñidas con TM, fue aumentando a medida que aumentaba el grado de malignidad de las muestras, lo que coincidió con el análisis de las mismas muestras que identificó los vasos sanguíneos mediante inmunohistoquímica contra CD31. Esto coincide con lo reportado por Mohtasham et al. (2010), Astekar et al. (2012), Michailidou et al. y Pyziak et al. (2013).

Al comparar la DMV de la totalidad de las muestras entre TM y la identificación de CD31, no se encontraron diferencias entre ambas. Además, se obtuvo una correlación significativa, siendo esta última moderada. Estos hallazgos nos permiten proponer que la cuantificación de vasos sanguíneos en muestras de MON, DEO y COCE es posible mediante tinción de TM, considerándose una alternativa útil y comparable a la realizada mediante inmunohistoquímica contra CD31.

La principal limitación de nuestro estudio es el tamaño muestral reducido, siendo menor en comparación a otros estudios donde se evaluó la inmunohistoquímica contra CD31 (Li et al., 2005; Rössle et al., 2013; Gröbe et al., 2014), debido a la baja prevalencia de estas patologías en la población general.

A futuro, planteamos evaluar otras tinciones como el rojo carmín para la cuantificación de los vasos sanguíneos, permitiendo tener otras opciones de menores costos y mayor disponibilidad en pacientes con MON, DEO y COCE.

CONCLUSIÓN

El COCE es la neoplasia maligna más frecuente de la cavidad oral, cuyo grado de agresividad se correlaciona con un aumento en la DMV, medido tanto por tinción TM como por inmunohistoquímica contra CD31. No se encontraron diferencias en la DMV medidas por ambas técnicas y se observó una correlación moderada entre ambas. La tinción con TM podría representar hoy en día una alternativa viable y accesible para la evaluación de la DMV, siendo comparable a la inmunohistoquímica contra CD31.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean agradecer a Maureen Marshall su valiosa ayuda en la recolección de las muestras histológicas.

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Recibido: 15 de Mayo de 2017; Aprobado: 06 de Septiembre de 2017

Correspondencia a: E-mail: zhaidar@uandes.cl

Dirección para correspondencia: Prof. Dr. Ziyad S. Haidar, DDS, Cert Implantol., MSc OMFS, FRCS(Canada), FACS, MBA PhD. Professor and Scientific Director Faculty of Dentistry Universidad de Los Andes Santiago CHILE

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