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versión On-line ISSN 0718-0764

Inf. tecnol. vol.25 no.1 La Serena  2014

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-07642014000100005 

ARTÍCULOS ANÁLISIS MORFOLÓGICO EN EL PROCESAMIENTO ÓPTICO-DIGITAL DE IMÁGENES PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA DISQUINESIA CILIAR

MORPHOLOGIC ANALYSIS IN THE OPTIC-DIGITAL PROSECUTION OF IMAGES FOR THE DIAGNOSIS OF THE CILIARY DYSKINESIA

 

Myriam Herrera(1) y Alfredo Moreno(2)

(1) Departamento de Ciencias, Facultad de Ingeniería, Universidad Libre de Colombia, Bogotá-Colombia. (e-mail: myriam.herrerap@unilibrebog.edu.co)
(2) Departamento de Física, Instituto Superior Politécnico José Antonio Echeverría, La Habana-Cuba. (e-mail: amore@electrica.cujae.edu.cu)


Resumen

Se presenta el análisis morfológico en el procesamiento óptico digital de imágenes para caracterizar los cilios y en particular, sus componentes estructurales, asociados al movimiento ciliar. Esto se hace a partir del modelo de un corte transversal del mismo. Se desarrolla una morfología matemática con algoritmos  basados en herramientas de la segmentación de imágenes, para  ser aplicados a cortes transversales de cilios reales. Se estudiaron componentes estructurales tales como los microtúbulos, las dineínas, la membrana citoplasmática y las proyecciones radiales. La aplicación de procesos digitales  a imágenes obtenidas por microscopía electrónica de transmisión permitió evaluar el cambio de estructuras y anormalidades de cilios de mamíferos y a partir de estos resultados metodológicos, contribuir al diagnóstico de la disquinesia ciliar en mamíferos 

Palabras clave: análisis morfológico, procesamiento óptico digital, cilios, disquinesia ciliar.   


Abstract

The morphologic analysis in the digital optic prosecution of images to characterize the cilia and in particular, its structural components, associated to the ciliary movement is presented. This is done starting from the pattern of a traverse cut of the same one. A mathematical morphology is developed with algorithms based on image segmentation tools to be applied to traverse cuts of real cilia. Structural components such as microtubes, dynein, citoplasmatic membrane and radial projections. The application of digital processes to images obtained by electronic transmission microscopy allowed evaluating the change of structures and abnormalities of cilia in mammals and starting from these methodological results to contribute to the diagnosis of ciliary dyskinesia in mammals.

Keywords: morphologic analysis, digital optic prosecution of images, cilia, ciliary dyskinesia.



INTRODUCCION

Con el procesamiento óptico – digital de imágenes se han desarrollado diferentes algoritmos que han permitido el tratamiento de  imágenes obtenidas de muestras de materiales orgánicos e inorgánicos. Estos algoritmos han permitido leer e interpretar diferentes  características morfológicas y funcionales, así como realizar mediciones, transformaciones y reconstrucciones tridimensionales de los objetos estudiados utilizando lenguajes de programación. En los últimos años se ha incrementado el estudio de  ramas de ciencias de la vida y la tecnología a partir de procesamiento y análisis de imágenes que han marcado el avance en la investigación. Entre estos se encuentra la investigación del ADN (Hornef, 2006) y el estudio de la estructura de los fullerenos en nanotecnología (Tabata, 2002).

Gran información de las muestras de estos campos de la ciencia está en la dimensionalidad micrométrica  y nanométrica, "más de lo mismo, tal vez a otra escala" (Villaveces, 2005). Se hace necesario utilizar instrumentos ópticos, microscopios de alta resolución que permitan realizar observaciones de objetos de esas dimensiones y posteriormente diseñar procesamientos ópticos y digitales que incrementen el contraste, la nitidez y  la posibilidad de aprovechar de ellas la mayor información (Alfonso, 2010). En el estudio y caracterización de muestras biológicas es ampliamente utilizada la  microscopía Óptica y Electrónica, las cuales  han permitido captar información de dimensiones micrométricas y nanométricas (Haugland,1992; Pertuz, 2007).

El uso del microscopio electrónico de transmisión (TEM) ha permitido la caracterización de células y su estructura  (Morán, 1987).  Las partes de la célula que se han podido caracterizar por estos instrumentos son los cilios. Teknos, 1997).  Son estructuras cilíndricas (figura.1) que salen de la superficie de algunas células, miden entre 5 y 7 µm de longitud y son utilizados por los organismos unicelulares para impulsarse a través de líquidos y por organismos multicelulares para transportar fluidos (Barrett,2010).

 
a)    b)

Fig.1: Imagen de cortes (a) transversales y (b) longitudinales de cilios. (www1.unex.es/.../especialimembrana.htm)

La figura.2 muestra el modelo de la estructura de un cilio  normal. En a)  se resalta  en perspectiva la membrana plasmática, los brazos radiales, los microtúbulos periféricos y centrales; en b) se muestra el modelo del corte transversal del cilio normal. En él se observan los diferentes componentes del axonema ciliar que aparecen revestidos por una extensión de la membrana plasmática celular (MPC). Dentro de esta membrana se incluyen nueve pares de microtúbulos periféricos (MTP) y un par de microtúbulos centrales (PMC), denominada la disposición 9 + 2. Los microtúbulos se encuentran a lo largo de todo el citoesqueleto; es un grupo complejo de estructuras citoplasmáticas que interactúan armónicamente  constituyendo la base del movimiento ciliar (González, 2007).

 
a)   b)

Fig. 2. Estructura de un cilio normal: a) Modelo en perspectiva de la estructura cilíndrica (www.maph49.galeon.com), b) corte transversal de un cilio normal de una célula animal (Brauer, 2003).

Cada MTP está formado por el microtúbulo A (mTA) y el B (mTB). En la parte delantera del mTA hay dos brazos que son las dineínas ciliares (DC). Estas estructuras están formadas por la proteína responsable del movimiento ciliar. Estos brazos se denominan brazo externo e  interno. En el mTA también se encuentra un brazo  llamado nexina (N) que lo une con el mTB vecino del siguiente par. Esta estructura pasiva aparece cada 86 nm a lo largo de los microtúbulos (Brauer, 2003). El PMC está formado por dos microtúbulos independientes. Estos microtúbulos están unidos por una estructura pasiva llamada Kinesina (K),  envueltos parcialmente por una vaina interna (VI) que aparece cada 14 nm a lo largo del cilio. Por último aparece una estructura pasiva proteica denominada proyección radial (PR) que sale de cada PMP y se proyecta hacia el PMC a intervalos de 29 nm (Fajardo, 2003).

Dentro de las funciones de los cilios en los organismos multicelulares está la del movimiento de fluidos (Romero, 2003). Esta función es realizada a partir del movimiento de las diferentes poblaciones de cilios existentes en estos organismos. El movimiento del cilio a su vez está determinado por varios de sus componentes estructurales, entre los que se destacan, los microtúbulos, las dineínas, los puentes de nexina y las proyecciones radiales. Los microtúbulosque forman los pares son organelos inestables ya que pueden ensamblarse y disgregarse rápidamente dependiendo de factores físicos y químicos como temperatura, presión, concentración de iones de calcio, pH y alcaloides. La dineína es la responsable del deslizamiento de los microtúbulos, dando origen al movimiento y batir armónico de los cilios, mientras que los puentes de nexinas y las proyecciones radiales son las encargadas de restituir el cilio a su posición inicial (Yates, 2007).

La ausencia o deformación de alguna de las proteínas  altera la estructura del cilio en forma general haciendo que los mutantes pierdan capacidad de motilidad. Hay varios procesos fisiológicos que se ven afectados por estas alteraciones, presente en mamíferos con dificultades para drenar las secreciones del tracto respiratorio. Esta dificultad es un factor determinante en la patología denominada Disquinesia Ciliar Primaria (DCP), elemento utilizado para el diagnóstico de diferentes enfermedades en mamíferos y en el caso particular de humanos en patologías como el Síndrome de Kartagener (SK), (Fernández, 2011; Kartangener, 1993; Teppa, 2004; Valenzuela, 1980) y el Síndrome de Young (SY) (Chin, 2002), consideradas como Enfermedades Raras (Benavides, 2011).

El procesamiento óptico–digital de imágenes es ampliamente utilizado en el estudio, análisis y caracterización de tejidos biológicos (Herrera, 2008). Los algoritmos y los descriptores utilizados para la extracción de información a partir de imágenes,  varían de acuerdo a los objetivos de cada aplicación. En la bibliografía relacionada con el tema, se encuentra que para el estudio de lesiones arteriales se ha utilizado métodos que consisten en aplicar un preprocesamiento de la imagen y posteriormente desarrollar algoritmos de la segmentación de imágenes, dentro de los que se destacan el de Kolmogorov - Smirnov (Rodríguez, 1997). En el estudio de defectos internos de frutos se utiliza el procesamiento de imágenes aplicando algoritmos de segmentación en la imagen de la pulpa, para posteriormente desarrollar operaciones aritméticas y morfológicas que permitan buscar umbrales para detectar daños internos invisibles (Aristizábal, 2006).

De forma general en la caracterización de las estructuras de tejidos biológicos se utilizan algoritmos y descriptores basados en la morfología matemática y la segmentación de imágenes (Madrigal, 2007;Herrera, 2009). Sin embargo, al realizar un balance de las investigaciones en las que se obtienen imágenes de las estructuras ciliares, solo se ha observado el uso del procesamiento óptico-digital para: la obtención de imágenes, la mejora de la calidad de las imágenes, la obtención de estadísticas de diferentes deformaciones celulares vinculadas a patologías estudiadas, etc.; pero    no se observa el uso de herramientas de morfología matemática y segmentación en el análisis de estas imágenes (Ferrer, 2009; Esmendi, 2006). Es así que el objetivo de esta investigación es aplicar algoritmos de la morfología matemática y la segmentación en el procesamiento de imágenes del epitelio pulmonar donde están presentes los cilios, que permitan aportar criterios de la deformación estructural del mismo, aspecto que permite diagnosticar deficiencias en la movilidad ciliar.

Atendiendo a esta problemática, es de interés de esta investigación, aplicar el procesamiento óptico digital de imágenes para el estudio morfológico de cilios y en particular de los componentes estructurales asociados al movimiento ciliar. Con la aplicación de ciertos algoritmos a las imágenes digitales, se podrá evidenciar la presencia o no de membranas, dineínas, microtúbulos o la alteración según el modelo celular, que permiten caracterizar el corte biológico del tejido de los mamíferos que han sido diagnosticados con este problema ciliar.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño de experimento

Para realizar el estudio morfológico de los cilios, primero se utilizaron modelos de cortes transversales de cilios para establecer los algoritmos necesarios del procesamiento de imágenes para luego aplicarlos en imágenes de las biopsias de mamíferos (Rodríguez, 2007). Las imágenes reales que se utilizaron, son cortes ciliares de biopsias de la mucosa bronquial de dos pacientes caninos. Para obtener las imágenes se sigue el protocolo necesario en la preparación y fijación de las biopsias. Se obtienen cortes transversales ultrafinos de 90nm con el ultramicrótomo, contrastadas con acetato de uranilo y citrato de plomo y finalmente son observadas y registradas las imágenes con el microscopio electrónico de transmisión TEM, JEOL JEM 1200EX II (Jurado, 2008). Para el procesamiento de las imágenes y de otros procesamientos estadísticos se utilizaron programas desarrollados para lainvestigación en lenguaje MATLAB 7.9 (R2009b) (MatWork Inc. USA) y el IMAGEJ.

Metodología

Para realizar la caracterización morfológica de los cilios se aplica la siguiente metodología: i) Seleccionar imágenes de un cilio normal y determinar qué estructuras del mismo serán estudiadas por el procesamiento óptico digital. Hacer un preprocesado del modelo para el mejoramiento de la imagen; ii) Establecer, desarrollar y aplicar algoritmos de morfología que permitan describir la deformación del cilio a partir del modelo del cilio; y iii) Aplicar los algoritmos y descriptores desarrollados en imágenes de microscopía electrónica de cilios reales, que permitan reconocer, clasificar e interpretar la deformación de los cilios.

A partir de analizar los componentes del modelo cilio  normal y fundamentalmente  las estructuras relacionadas con la movilidaddel mismo, se determina qué  algoritmos y descriptores se van a aplicar para valorar: la ausencia de la MPC, la ausencia de algún microtúbulo de los PMP o del PMC y la ausencia de las dineínas, como elementos determinantes en el análisis del buen funcionamiento de los cilios. Esta decisión se basa en que, de los elementos estructurales del cilio que están relacionados con la movilidad del mismo, sólo estos elementos se encontrarán siempre en una imagen de microscopio de un corte transversal del cilio realizado en cualquier plano a lo largo del mismo. Las otras componentes del cilio que participan en su movilidad , son las nexinas y las proyecciones radiales; estas estructuras solo aparecen en determinadas ubicaciones a lo largo del cilio. Por tal motivo la presencia de ellas en el corte transversal del cilio está en dependencia de por donde se realice dicho corte. Esta incertidumbre determina que no se desarrollen los algoritmos y descriptores que valoren la presencia o no en las imágenes de cortes transversales del cilio de estas estructuras. Los algoritmos a aplicar y desarrollar se basan en las herramientas del análisis morfológico y de la segmentación de imágenes. Las funciones relacionadas con estos procedimientos tienen sus fundamentos en la teoría matemática de los conjuntos.

RESULTADOS Y DISCUSION

Se selecciona como imagen el modelo del cilio normal mostrado en la figura.2b). Sobre este corte transversal se hace el pre procesamiento de la imagen del cilio para aplicarle los diferentes algoritmos. Este pre procesamiento consiste en mejorasde contrastes, de intensidad, de filtrado de la imagen tratando de mantener definidos los bordes de las estructuras internas. Finalmente se realiza la binarización, inversión y filtrado de la misma (figura.3).

 
a)   b)

Fig. 3: Modelo del corte transversal de un cilio normal preprocesada: a) filtrada y   b) binarizada

Caracterización de la MPC

La ausencia de la MPC es el aspecto fundamental a tener en cuenta al analizar la deformación del cilio. Para caracterizar su ausencia se desarrollaron algoritmos que se aplicaron primero en el modelo del cilio. La estrategia seguida consistió en  la eliminación de todas las estructuras internas del cilio dejando solo su MPC. A partir de la imagen de la figura.3(b) se utilizaron funciones de la morfología matemática (shrink, erode y open) y se eliminaron  las estructuras internas, dejando solo la membrana (figura.4).

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Recibido Jun. 14, 2013; Aceptado Ago. 9, 2013; Versión final recibida Ago. 25, 2013