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versión On-line ISSN 0718-0764

Inf. tecnol. vol.27 no.2 La Serena  2016

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-07642016000200009 

Cinética de Inactivación Térmica de la Enzima Pectinmetilesterasa en Zumo de Tomate de Árbol (Solanum betaceum Cav.)

 

Kinetics of Thermal Inactivation of the Enzyme Pectinmethylesterase in Tamarillo Juice (Solanum betaceum Cav.)

 

Andrés F. Cerón, Diego F. Mejía y Oswaldo Osorio

Universidad de Nariño, Facultad de Ingeniería Agroindustrial, Grupo de Apoyo a la investigación y Desarrollo Agroalimentario (GAIDA), Ciudad Universitaria Torobajo, Calle 18 Cr 50, San Juan de Pasto - Colombia. (e-mail: andre5505@hotmail.com; diegomejiaes@udenar.edu.co; osorio_oswaldo@hotmail.com)


Resumen

Se determinó la cinética de inactivación térmica de pectinmetilesterasa (PME; EC3.1.1.11) en zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.). Se evaluó el comportamiento de la enzima a temperaturas entre 50 y 80 °C y tiempos entre 5 y 60 s. La actividad enzimática residual (AR) se midió por espectrofotometría. Se determinó el contenido de carotenoides totales a temperaturas-tiempos con AR ≤ 10%. La cinética se estudió bajo modelo de primer orden bifásico. Las constantes KR calculadas fueron: 0.077 min-1 a 50 °C, 0.623 min-1 a 60 °C, 15.34 min-1 a 70 °C, y 19.88 min-1 a 80 °C. Las constante KL fueron 0.778 min-1 a 50°C y 2.783 min-1 a 60 °C La representación de Arrhenius dio para EaR un valor de 189.6 kJ/mol. No se encontró diferencia significativa para contenido de carotenoides totales a 70 y 80 °C x 10 y 7 s. Se concluye que a temperaturas ≥ 70 °C x 10 s se obtiene AR ≤ 10%, evidenciando pérdidas de carotenoides del orden del 11.2%.

Palabras clave: inactivación térmica; cinética pectinmetilesterasa; tomate de árbol; Solanum betaceum Cav.


Abstract

The kinetics of thermal inactivation of pectinmethylesterase (PME; EC3.1.1.11) was performed on tree tomato juice (Solanum betaceum Cav.). The behavior of the enzyme at temperatures between 50 and 80 ° C and times between 5 and 60 s was evaluated. The residual enzyme activity (AR) was measured by spectrophotometry. The content of total carotenoids (CT) at temperatures-time AR ≤ 10% was determined. The kinetics was studied under a two-phase model of first order. The calculated constants KR were 0.077 min-1 at 50 °C, 0.623 min-1 at 60 °C, 15.34 min-1 at 70 °C, y 19.88 min-1 at 80 °C. The constants KL were 0.778 min-1 at 50°C y 2.783 min-1 at 60 °C. Arrhenius representation yielded a value of 189.6 kJ/mol for EaR. No significant difference in total carotenoids was found at 70 and 80 °C x 10 and 7 s. It is conclude that AR ≤ 10% are obtained at temperatures ≥ 70 ° C * 10 s, showing losses of carotenoids of the order of 11.2%.

Keywords: thermal inactivation; kinetics; pectinmethylesterase; tamarillo; Solanum betaceum Cav.


 

INTRODUCCIÓN

El tomate de árbol (Solanum betaceum Cav Syn Cyphomandra betacea sendt) conocido también como "Tamarillo" es un pequeño árbol, perteneciente a la familia de las solanáceas (Do Nascimento et al., 2013), nativo de los Andes Peruanos y probablemente también de Chile, Ecuador y Bolivia (Alvarado et al., 2011); el fruto presenta gran potencial para el mercado debido a sus características nutricionales y organolépticas (Márquez, et al., 2007; Lagos et al., 2013; Andrade et al., 2013), siendo muy atractivo para la industria de bebidas y alimentos (Rodríguez et al., 2011). Villarreal et al., (2013) exponen que la transformación agroindustrial, se ha enfocado en la obtención de pulpas y jugos naturales (zumos); estos últimos se definen como líquidos sin fermentar pero fermentable, que se obtiene de la parte comestible de las frutas en buen estado (NTC 5468, 2007); los nuevos consumidores los prefieren debido a que mantienen las características físicas, químicas, sensoriales y nutricionales de la fruta.

Sin embargo, Maca et al., (2013) mencionan que el zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.), está expuesto a la acción de la enzima pectinmetilesterasa, PME (EC 3.1.1.11), la cual ocasiona una pérdida de estabilidad en los jugos turbios, desencadenando en una clarificación (Wilinska et al., 2008; Pinchao et al., 2014) y pérdida de consistencia. Por lo tanto, conocer y estudiar la actividad enzimática de las frutas es importante para encontrar las condiciones más adecuadas en el momento de su industrialización (Villareal et al., 2013). Cruz, Vieira & Silva (2008), afirman que los tratamientos térmicos son los métodos más utilizados para estabilizar bebidas, debido a que tienen la capacidad de destruir microorganismos e inactivar enzimas. Entre estos tratamientos la pasteurización se destaca en la inactivación de la enzima PME, como lo reporta Maca et al., (2013), por ser un método general para líquidos (Garnacho et al., 2012). Ahora bien, Agüero et al., (2008) señalan que los estudios sobre cinética enzimática son únicos para cada especie y variedad, tanto de frutas como vegetales. En este contexto, el objetivo de esta investigación fue realizar la cinética de inactivación térmica de la enzima PME, en zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) a presión afmosferica, determinando algunos parámetros cinéticos (K, D, Z y Ea) y evaluando el efecto de los tratamientos con actividad enzimática residual < a 10% sobre el contenido de carotenoides totales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Caracterización materia prima

Se utilizaron tomates de árbol (Solanum betaceum Cav.) comunes, cultivados en el municipio de Buesaco, Nariño, ubicado a 2000 msnm, con una temperatura promedio de 18 °C. Los tomates fueron recolectados según la Norma Técnica Colombiana, NTC 4105, se optó por la categoría extra, calibre B y color número 6 solo frutos totalmente anaranjados. Posteriormente se realizó la caracterización del material mediante análisis químico proximal determinando: humedad, sólidos totales, ceniza, proteína, carbohidratos totales, fibra cruda, acidez, según el método de análisis de alimentos propuesto por Bernal (1998).

Extracción del zumo

Se realizó de acuerdo a la metodología reportada por Maca et al., (2013); mediante la cual se llevó a cabo un lavado y desinfección, posterior pelado y triturado en una licuadora industrial JAVAR LCT-15. El zumo obtenido se filtró, homogenizó y empacó en bolsas de polietileno calibre 2 con capacidad de 50 mL, las cuales se almacenaron a -23 °C, con el fin de evitar variabilidad en los resultados.

Tratamiento térmico

Se realizó a presión afmosférica a diferente temperatura 50, 60, 70 y 80 °C con exposición de entre 5 y 60 s, en el centro térmico; se utilizó la metodología descrita por Soysa &, Soylemez (2005), mediante la cual se tomó 5 mL de extractos crudos en tubos de ensayos de longitud 80 x 10 mm, grosor de pared 0.6 mm y capacidad volumétrica 5 mL; los tubos se calentaron en un baño de agua termostatado marca Eyela OSB 2000 con capacidad de 10 litros y precisión de 0.1°C; culminado cada tratamiento las muestras se enfriaron rápidamente en un baño agua-hielo a temperatura de 2°C. La temperatura se midió con un lector de temperatura portátil (OAKTON TEMP-300), al cual se acopló un termopar tipo K.

Obtención del extracto enzimático

Se realizó de acuerdo al método reportado por Maca et al., (2013), se tomó 5 g de zumo tratado con 15 mL de cloruro de sodio (NaCl) 1 M y 0.04 g de polivinilpirrolidona (PVPP). La suspensión obtenida se agitó por 1 h a 200 rpm a temperatura ambiente y luego se centrifugó a 10000 rpm por 1 hora a 4 °C, se utilizó tubos

Falcon de 15 mL. Se recogió el sobrenadante el cual es el extracto enzimático esta muestra se mantuvo en refrigeración. Se obtiene un extracto enzimático a pH 3 y antes de ser utilizado se ajustó el pH a 7.5. Medición actividad enzimática

Se utilizó un espectrofotómetro Genesys 10 (Thermo Scientific) UV-VIS con escaneo de 6 celdas, aplicando la metodología de algunos autores citados por Maca et al., (2013) mediante la cual se mezcló 95 μL de agua destilada, 1765 µL de pectina cítrica al 0.5% (w/v) (>85% esterificación, Sigma®), 445 µL de azul de bromotimol al 0.01% en buffer fosfato de sodio al 0.006M y 495 µL de extracto enzimático. Todos los reactivos se ajustaron a pH 7.5 con hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N y 1N. El cambio de color se midió a una longitud de onda de 620 nm. La pendiente de la parte lineal de la curva (velocidad inicial de la reacción) se tomó como actividad enzimática. Los resultados se expresaron como el cambio en la densidad óptica por minuto (ΔAbs/min). La actividad residual enzimática (AR), se define como la relación entre la actividad de la enzima después del tratamiento, a la actividad que tenía antes del mismo. Su cálculo se realiza utilizando la ecuación 1 (Tiwari et al., 2009).

(1)

Donde: %AR: actividad enzimática residual en porcentaje; At: Actividad de PME después del tratamiento térmico; Ao: Actividad de PME antes tratamiento térmico.

Determinación parámetros cinéticos

Se determinaron a partir de las metodologías descritas por Balogh et al., (2004), Espachs et al., (2006) y Ordóñez & Yoshioka, (2012); las constantes cinéticas de velocidad de inactivación térmica, se calcularon de acuerdo a los resultados de la actividad enzimática residual como un modelo de primer orden bifásico (ecuación 2), con el método de mínimos cuadrados.

(2)

La energía de activación se estimó por análisis de regresión lineal del logaritmo natural de la constante de velocidad frente a la inversa de la temperatura absoluta (ecuación 3 Arrhenius).

(3)

El tiempo de reducción decimal (valor D) se calculó mediante la relación entre el valor D y la constante de inactivación (k) ecuación 4.

(4)

La constante de resistencia térmica (Z) se determinó a partir de una gráfica del log10 (D) en función de la temperatura (ecuación 5).

(5)

Donde: A: ΔAbs/min después del tratamiento térmico; A0: Abs/min sin tratamiento térmico; t: tiempo (min); AR: fracción de la enzima resistente al calor; AL: fracción de la enzima lábil al calor; KR y kL: constantes de inactivación para la fracción de la enzima resistente y lábil al calor, Ea: energía de activación en KJ/mol; R: constante universal de los gases (8.314 J/mol °K); T: temperatura absoluta en grados kelvin (K); D: reducción decimal; Z: constante de resistencia térmica.

Determinación de carotenoides totales

Se realizó de acuerdo a la metodología de Belén et al., (2004) con algunas utilizando un espectrofotometría utilizando Genesys 10 (Thermo Scientific) UV-VIS con escaneo de 6 celdas a una longitud de onda de 450 nm, mediante el cual se realizó una curva de calibración de B-caroteno Sigma®, en un rango de 0.5 a 4.0 μg BC /mL. Se tomaron 0.1 g de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.), de las condiciones temperatura-tiempo con actividad enzimática residual ≤ a 10% previamente secos a 40±1°C (Durán y Moreno, 2000), la cantidad se depositó en un tubo Eppendorf, posteriormente se adicionó 1.5 mL de una solución diclorometano: hexano en relación 1:1, se agitó y sonificó por 10 minutos a temperatura de 25 °C, frecuencia de 25 KHz y potencia del 99%; una vez culminada la operación se realizó una centrifugación a 14000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente. Se extrajo el sobrenadante y se almacenó en frasco vidrio ámbar de capacidad 2 mL hasta el momento de la medición.

Análisis de datos

Todos los resultados se expresaron como media más o menos la desviación estándar. Los análisis de regresión fueron realizados con ayuda del programa Sigma Plot 10 (SPSS, USA); mientras que el análisis de resultados se realizó con el programa InfoStat versión 2014, mediante el cual se hizo el análisis de varianza y prueba de comparación mediante la LSD de Fisher a un 5% de nivel de significancia

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización materia prima

En la Tabla 1 se muestran los resultados del análisis químico proximal realizado al zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.), valores similares reporta Santander et al., (2013) en tomate de árbol cultivado en el departamento de Nariño- Colombia, Torres (2012) en tomate de árbol procedente de Jarillo, Estado Aragua- Venezuela y Ramírez (2008) en tomate de árbol cultivado en Loja-Ecuador; sin embargo, difieren de los presentados por Repo y Encina (2008) en tomate de árbol procedente de Junin- Perú, reportando un menor contenido en humedad 82.9% y contenidos superior en: carbohidratos 14.1% y fibra 4.5%. Estas variaciones se atribuyen a modificaciones en el cultivo, clima, suelo, variedad del fruto, entre otras (Santander et al., 2013).

Tabla 1: Composición proximal zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.)

Actividad residual enzima PME

En la Figura 1 se presenta la actividad residual de la enzima PME en porcentaje como una función del tiempo a 4 temperaturas diferentes, conforme aumentó la temperatura la desnaturalización de la enzima se incrementó. Los resultados evidenciaron que temperaturas superiores o iguales a 70 °C con tiempos de exposición de 10 s, logran una reducción de la actividad enzimática igual o inferior a 10%, pasado este tiempo la velocidad de inactivación se torna lenta, en promedio 0.00101 ± 0.000073 ΔAbs/min. Temperaturas de 60°C x 60 s, conllevan a que la enzima mantenga una activada residual igual al 24.463 ± 2.681%.

Fig. 1: Actividad enzimática residual PME: • 50 °C; ▼ 60 °C; ▲ 70 °C; ♦ 80 °C.

Estos resultados difieren de los valores obtenidos para PME purificada, reportados por Maca et al., (2013) quien afirma que bajo condiciones de 60 °C x 5, 12 y 20 s, se logra reducir la actividad de la enzima por debajo de 10%, explicación de lo anterior es el uso de los extractos crudos de zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) en esta investigación. Balogh et al., (2004) reportaron conclusiones similares, afirmando que la PME purificada de zanahoria es más sensible a la temperatura en comparación con la PME del jugo y la PME de piezas de zanahoria, siendo esta última más termoestable. Agcam et al., (2014) reportaron para jugo de naranja valores de actividad residual de PME de 6.8% y 4.2%, obtenidos a temperaturas de pasteurización de 90°C por 10 y 20 s, respectivamente; al analizar el tiempo del tratamiento con los valores de tiempo expuestos en esta investigación, se afirma una baja termo-estabilidad de la enzima, siendo el aumento de la temperatura quien influye en mayor medida en la actividad de PME (Vivar et al., 2007). Sin embargo, Espachs et al., (2006) mencionan que la resistencia térmica de PME dependerá en gran medida de su origen; en su investigación concluyen que la PME del extracto de naranja es más termo resistente que el obtenido de zanahoria, pese a ello temperaturas iguales o superiores a 72 °C logran la inactivación, similar a lo expuesto en este trabajo.

Parámetros cinéticos

Durante los primeros 20 s para temperaturas de 50 y 60 °C, mientras que a temperatura de 70 y 80 °C este fenómeno se observa en los primeros 10 s. Pasados estos tiempos se observó cambios leves de la pendiente a 50 y 60 °C, mientras que a 70 y 80 °C se evidencia una reducción lineal de la actividad pero en una cantidad no significativa; Vivar et al., (2007) reportó igual conclusión en Crataegus pubescensun afirmando que en los extractos crudos, muchos factores tales como la presencia de proteínas diferentes a la PME, isoenzimas o agregados de proteínas podrían influir en la estabilidad térmica; de igual forma Soysal y Soylemez (2005) describen el fenómeno como la presencia de una fracción termolábil y otra resistente al calor; siendo necesario describir este fenómeno con un modelo de primer orden bifásico.

Fig. 2: Inactivación térmica PME en zumo de tomate de árbol, utilizando un modelo bifásico: Fracción estable: (A) • 50 °C; ▼ 60 °C; ▲ 70 °C; ♦ 80 °C. Fracción lábil: (B) • 50 °C; ▼ 60 °C.

En la Tabla 2 se muestra los valores de las constantes cinéticas de velocidad de inactivación en la fracción estable y lábil (KR y KL) obtenidos a partir de la Figura 2 (datos normalizados). Las grandes diferencias entre KR y KL indican que las condiciones utilizadas para el cálculo fueron adecuadas. Conforme aumentó la temperatura las velocidades de inactivación fueron mayores; conclusión similar reportaron Balogh et al., (2004) en la inactivación de PME en zanahoria y Wilinska et al., (2008) en la inactivación de PME en jugo de manzana y moras silvestres; este último encontró valores de K en el intervalo de 0.010 y 1.93 min-1, obtenidos a temperaturas de 52 y 66 °C, respetivamente; los valores a 60°C, encontrados en esta investigación para la fracción lábil (2.783 min-1), difieren de los anteriores, siendo la PME del zumo de tomate de árbol más sensible al calor. Según la prueba de la LSD de Fisher a un 95% de confianza existen diferencias significativas entre las constantes cinéticas K (p<0.05) (Tabla 2).

Al comparar los tiempos de reducción decimal (valores-D) (Tabla 2) en el rango de temperatura de 70 a 80 °C no se evidenciaron diferencias significativas según la prueba de la LSD de Fisher a un 95%; mientras, que en el intervalo de temperatura de 50 a 60 °C, PME de tomate de árbol, a pesar de presentar altos valores de (K) sigue siendo más termoestable que otras frutas. Los valores Z (°C) estimados de la pendiente del logaritmo del valor D de las fracciones lábil y estable al calor frente a la temperatura se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2: Parámetros cinéticos inactivación térmica de PME en las fracciones resistentes y lábiles en zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.). Letras no comunes implican diferencias entre promedios, según prueba de LSD de Fisher a un 95% de confianza.

Respecto de la dependencia de las constantes de velocidad de inactivación con la temperatura (Figura 3), la energía de activación solo se calculó para la fracción estable, debido a la ausencia de puntos para la fracción lábil. Sin embargo, Espachs et al., (2006) y Soysa y Soylemez, (2005) reportan que el valor de energía de activación de la fracción lábil debe ser menor en comparación con la fracción estable.

Fig. 3: Gráfico de Arrheniu s (A) fracción estable: Y=-22778.246 x + 68.106; R2= 0.932.

El valor de Ea obtenido en la fracción estable 189.595 kJ/mol, difiere de la reportada en otros productos: Banana (Musa acuminata, cv Cavendish) 379 kJ/mol, tomate (Lycopersicon esculentum) 369 kJ/mol y zanahoria (Daucus carrota L.) 336 kJ/mol (Espachs et al., 2006); siendo la PME del zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) más sensible a la temperatura. 189.595 kJ/mol seria la mínima energía necesaria para la inactivación de PME en esta fruta. Valores cercanos a los obtenidos en esta investigación son los reportados por Terefe et al., (2009) para PME en jugo de tomate (Lycopersicon esculentum) 193 kJ/mol un 47.69% inferior al valor reportado por Espachs et al., (2006) en la enzima purificada y Vivar et al., (2007) en PME de tejocote (Crataegus pubescens) 146.16 kJ/mol.

Carotenoides totales

Yanza y Maldonado (2012) mencionan que el color naranja de la pulpa del tomate de árbol se debe a la presencia de carotenoides, siendo este fruto fuente importante de ellos (Meza y Manzano, 2009^ Osorio et al., 2012). En la Figura 4, se muestra el efecto de los tratamientos térmicos durante la inactivación de PME en el contenido de carotenoides. Los valores expuestos para el testigo 6.371 mg BC/100 g de muestra, se encuentran dentro del rango de valores expuestos en otras investigaciones: 4.00 mg/100 g de muestra (Repo y Encina, 2008), 5.00 mg/100 g de mesocarpio + endocarpio (Cuesta et al., 2013) y 2.60 a 11.20 mg/100 g (Acosta et al., 2014), las variaciones se atribuyen a modificaciones en el cultivo, clima, suelo, variedad del fruto, entre otras (Santander et al., 2013).

Según el análisis de varianza (ANOVA), se determinó diferencias estadísticamente significativas (p-valor=0.000); entre los zumos tratados a 70 y 80 °C x 10 y 7 s, respectivamente, frente a un testigo sin tratamiento térmico; la prueba de medias e intervalos al 95 % de la LSD de Fisher, mostro que los tratamientos a 70 y 80 °C, no presentan diferencia significativa; considerándose los dos tratamientos como adecuados en la inactivación de PME.

Fig. 4: Medias e intervalos al 95 % de la LSD de Fisher para la variable contenido de carotenoides totales.

Respecto de la disminución en el contenido de carotenoides, por efecto de los tratamientos; Rocha, Fávaro & Ferreira (2012) mencionan que son sensibles a diversos factores: luz, presencia de oxígeno y las altas temperaturas, siendo esta última quien influye en mayor grado (Jacob et al., 2010). Según Meléndez et al., (2004) la pasteurización ocasiona variaciones significativas en el contenido total de los carotenoides, explicando lo evidenciado en la Figura 4.

Otras investigaciones, como la realizada por Mertz et al., (2010) en la cual se sometió néctares de tomate de árbol a temperaturas de 80, 90, y 95 °C x 10 min, se encontró pérdidas significativas, siendo los carotenoides zeaxantina y B-caroteno los más afectados. Pese a lo anterior los néctares de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) mantienen una cantidad significativa de carotenoides totales como lo reportan Rawson et al., (2011), en comparación con lo evidenciado por Oliveira et al., (2012) durante el tratamiento de térmico de melocotón a 90 °C x 5 min en el centro térmico, encontrando pérdidas en carotenoides totales de 65%.

CONCLUSIONES

En el zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) crudo, la enzima PME fue inactivada térmicamente por pasteurización a temperaturas ≥ a 70 °C durante 10 segundos, siendo de importancia este resultado para el procesamiento de esta fruta.

La cinética de inactivación térmica de PME en zumo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) evidencia la presencia de una fracción termolábil y otra resistente al calor; siendo necesario describir este fenómeno con un modelo de primer orden bifásico.

No se encontró diferencia significativa, entre los tratamientos a 70 °C x 10 s y 80 °C x 7 s, en el contenido de carotenos totales, evidenciando pérdidas iguales a 11.205 % y 13.795 %, respectivamente.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a: La Universidad de Nariño - La Vicerrectoría de Investigaciones, Postgrados y Relaciones Internacionales (VIPRI). - COLCIENCIAS por la convocatoria 566 del 2012, Jóvenes Investigadores e Innovadores y Grupo de investigación Tecnologías Emergentes en Agroindustria (TEA) y Grupo de Apoyo a la investigación y Desarrollo Agroalimentario (GAIDA).

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Recibido Ago. 25, 2015; Aceptado Nov. 2, 2015; Versión final Nov. 7, 2015, Publicado Abr. 2016

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