INTRODUCCIÓN

La producción de cerveza corresponde principalmente al procesamiento de cebada malteada e incluye etapas de maceración, cocción, fermentación y maduración. La maceración, tiene como objetivo la activación enzimática, extracción de sustancias fenólicas, azúcares simples y compuestos nitrogenados requeridos para el siguiente proceso fermentativo. Posterior a la maceración se realiza una filtración para separar todo el material orgánico del mosto, obteniéndose como residuo la cascarilla de cebada malteada, conocida como Brewer's spent grain (BSG) (Figura 1), representando el 85% de los subproductos generados en esta industria (^{Mussatto et al., 2013}). A nivel mundial, se ha reportado un promedio de 34 millones de toneladas de BSG (^{Xiros y Christakopoulos, 2012}). En Colombia, la industria cervecera se caracteriza por un nivel elevado de concentración industrial, diferenciación de productos y explotación de economías de escala (^{DNP, 2019}). Para 2017, la producción de cerveza en litros fue de 2189 millones (^{Barth, 2018}) liderando el mercado de licores y bebidas del país con un consumo anual de un millón de hectolitros (^{ProChile, 2011}). Así, esta biomasa residual, por su disponibilidad y composición se convierte en materia prima potencial para otros procesos como biocombustibles líquidos y gaseosos (^{Aliyu y Bala, 2013}; ^{Zhang y Zang, 2016}; ^{Wilkinson et al., 2015}); como sustrato para la obtención de compuestos bioactivos, antioxidantes, monosacáridos, oligosacáridos, xilitol, arabitol, ácidos orgánicos, proteínas, y lípidos, entre otros productos de alto valor agregado (^{McCarthy et al., 2013}; ^{Liang y Wan, 2015}; ^{Lynch et al., 2016}). Actualmente, los destinos más comunes de la cascarilla de cebada malteada corresponden a suplementos en dieta animal presentando muchos beneficios nutricionales, y compostaje para la obtención de abonos para el mejoramiento de suelos (Mussatto et al., 2014).

Fig. 1: Proceso cervecero y aprovechamiento de Cascarilla de Cebada Cervecera. 

El potencial económico del brewer's spent grain radica en sus componentes lignocelulósicos principalmente celulosa, hemicelulosa y lignina, y otros compuestos minoritarios como extractivos hidrofílicos y lipofílicos que cumplen una función no estructural. En general, el fraccionamiento de las cuatro categorías en todo material lignocelulósico permite obtener una amplia gama de productos químicos como biocombustibles, productos bioquímicos industriales y biomateriales de importancia industrial bajo el concepto de biorefinería (ruta promisoria para la creación de una economía de base biológica) que es análogo a la refinería de petróleo la cual toma hidrocarburos para la obtención de derivados comerciales (^{Ghatak, 2011}; ^{Venkata Mohan et al., 2016}). Específicamente, en el BSG el contenido de celulosa oscila entre el 15 y 26%, hemicelulosa 22 - 40%, lignina 4 - 28%, proteína 14 - 24%, almidón 2 - 8%, cenizas 2 - 5%, extractivos 6 - 11% (^{Mussatto et al., 2013}; ^{McCarthy et al., 2013}). La variabilidad en composición está ligada a diversos factores entre ellos los correspondientes al eslabón primario o prácticas agronómicas del cultivo de cebada, variedad, condiciones bioclimáticas, edáficas y de ubicación en altitud, en procesos de transformación el tipo de malteado, secado y molienda, en el proceso cervecero a nivel artesanal o industrial influye el tipo de maceración sea sencilla o escalonada (^{Mussatto et al., 2006}).

En el caso de biocombustibles, la bioconversión de la matriz polimérica o lignocelulósica del BSG requiere de pretratamientos térmicos, físicos y/o químicos para producir azúcares fermentables, seguido de una fermentación. El uso de álcalis, ácidos y solventes orgánicos son los pretratamientos más frecuentes por la eficiencia en la liberación de azúcares, sin embargo, la aplicación de altas concentraciones imposibilita la recuperación de sólidos, generan compuestos inhibitorios para los procesos fermentativos e incrementan costos de producción (^{Ravindran et al., 2018}). La ruta termoquímica, específicamente la pirólisis permite obtener y controlar de manera más sistemática numerosos productos químicos (^{Borel et al., 2018}), aunque hay restricciones ya que son tecnologías con altos requerimientos energéticos. Por otro lado, las conversiones por ruta biológica son preferidas a la química por ser más selectivas y promisorias para la consecución de etapas más limpias, aunque debido la complejidad de la biomasa lignocelulósica exige múltiples procesos para lograr eficiencia en las operaciones; adicionalmente, la lentitud de las reacciones biotecnológicas es una limitación y se requieren optimizar los tiempos de hidrólisis, rendimientos y productividad (^{Alvira et al., 2010}). En este contexto, el uso de aplicaciones enzimáticas para la degradación de materia orgánica ha sido ampliamente investigado en la producción de biocombustibles; debido a la naturaleza de los residuos orgánicos de fuente agro-industrial se han reportado evaluaciones de diferentes enzimas hidrolíticas con actividad β-glucanasa, celulasa, hemicelulasa, xilanasa, proteasas, lipasas (^{Wilkinson et al., 2017}; ^{Ravindran y Jaiswal, 2016}) y enzimas con actividad ligninolítica como peroxidasas y lacasas (^{El-Naggar et al., 2014}). La accesibilidad a la matriz polimérica se convierte en un desafío, entre las propiedades estructurales que dificultan el proceso de hidrólisis enzimática se menciona el grado de polimerización, hidrofobicidad, cristalinidad, área superficial, entre otras.

De acuerdo a ^{Niemi et al. (2012}), la aplicación de complejos enzimáticos de actividad hidrolítica genera una solubilidad de carbohidratos hasta del 48% en combinación con pretratamientos físicos en la cascarilla de cebada. Así, la presente investigación se enfoca al aprovechamiento de subproductos lignocelulósicos de la industria cervecera para maximizar el rendimiento de azúcares fermentables a través de combinaciones enzimáticas en función de concentración y tiempo de proceso con proyección a minimización de costos operacionales para una posterior obtención de bioetanol o aplicación en biocombustibles. Esto permitirá el fortalecimiento de dicha industria al aplicar procesos integrales que promuevan la generación de productos de valor agregado a través del aprovechamiento de residuos de un proceso, y en consecuencia contribuir al desarrollo sostenible.

MATERIALES Y MÉTODOS

En esta sección se describe la preparación del residuo lignocelulósico proveniente de la industria cervecera, las condiciones de operación en los tratamientos enzimáticos y sus correspondientes metodologías de caracterización.

Tratamientos enzimáticos en la cascarilla de cebada

Las enzimas evaluadas para el proceso hidrolítico corresponden a Viscozyme L (complejo multienzimático que contiene β-glucanasa, celulasa, hemicelulasa y xilanasa; derivado de A. aculeatus, actividad 100 FBG/g); Celluclast 1.5L (derivado de T. reesei, actividad ≥700 U/g); Hemicelulasa (derivado de A. niger 0.3-3.0 U/mg); y Xilanasa (derivado de A. oryzae ≥2500 U/g). Los tratamientos enzimáticos se efectuaron en un shaker bajo agitación constante a 250 rpm (MaxQ 4450, Alemania), pH 5.0 (buffer acetato 0.1 M), 50 °C y a una concentración de sustrato del 5% p/v.

Las evaluaciones enzimáticas se realizaron en función del tipo de enzima y dosificación (unidades de enzima por gramo de cascarilla en base seca) acorde a las especificaciones de la Tabla 1. El tratamiento C-H:X se realizó en dos etapas; posterior a la aplicación de Celluclast 1.5L se adicionó una mezcla de Hemicelulasa y Xilanasa; y el tratamiento H-V incluye la aplicación secuencial de Hemicelulasa y Viscozyme L. Finalizado el tiempo de hidrólisis las muestras fueron centrifugadas a 10000 rpm a 4 °C durante 10 minutos con el objetivo de extraer el sobrenadante para posterior análisis de azúcares reductores.

Tabla 1: Tratamientos enzimáticos aplicados sobre la cascarilla de cebada. 

Determinación de azúcares reductores

El efecto de las aplicaciones enzimáticas fue analizado en función de la liberación de azucares reductores utilizando el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Se utilizó una curva de calibración en función del estándar glucosa en concentraciones de 0 a 2 g/L (X = 1.58y+0.285, R² =0.9983, donde Y es la absorbancia y X los g/L de glucosa. La absorbancia fue determinada en un espectrofotómetro UV-Vis (UV-2550, Shimadzu, Japón) a una longitud de onda de 540 nm (^{Miller, 1959}). La determinación se realizó por triplicado. Las diferencias significativas entre cada tratamiento se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA) y prueba de Tukey para comparación de medias con un nivel de significancia del 5% utilizando el software Statgraphics versión XVI.I. El porcentaje de hidrólisis correspondiente a la equivalencia entre unidades de azúcares reductores con base a sustrato en peso seco se realizó con la ecuación 1:

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se presentan los resultados de los diferentes tratamientos enzimáticos sobre la cascarilla de cebada que corresponde al residuo lignocelulósico de la industria cervecera; y el respectivo efecto de las combinaciones de las enzimas Viscozyme L, Celluclast 1.5L, Hemicelulasa, y Xilanasa con dosificación y tiempo sobre la liberación de azúcares reductores expresada en g/L de glucosa.

La cascarilla de cebada presentó un contenido de celulosa equivalente al 26.56 ± 2.03%, este porcentaje se encuentra entre los rangos reportados por otros autores (^{Mussatto., 2014}). El alto contenido de celulosa lo hace un material viable para el tratamiento hidrolítico con enzimas de actividad celulasa. Con relación a los contenidos de hemicelulosa, lignina y cenizas, se presentaron valores de 31.92 ± 2.03, 22.31 ± 0.00 y 2.60 ± 0.04 respectivamente. En su composición también se encuentran extraíbles del tipo hidrosolubles y lipofílicos que pueden oscilar en un 16.5%. En la caracterización se destaca el alto contenido de lignina, al ser un heteropolímero tridimensional amorfo, principalmente construido con monómeros de base estructural correspondientes a unidades de fenil-propano, se convierte en el principal obstáculo en los procesos de degradación de la holocelulosa, es catalogado como agente segmentante con funciones estructurales y antimicrobianas. Al respecto, se han reportado aplicaciones exitosas con enzimas ligninolíticas, en concreto el sistema lacasa mediador ha permitido una eficaz degradación de lignina en materiales lignocelulósicos (^{Raj y Krishnan, 2018}), sin embargo en Brewer’s spent grain los estudios son escasos. En cuanto al análisis de minerales y proteína, presentó un contenido porcentual de calcio, fósforo y magnesio de 0.11, 0.30, 0.14 respectivamente; la concentración de potasio fue de 636 ppm y el contenido de proteína cruda de 18.7%. La cantidad presente de proteína y minerales en BSG es significativa (^{Xiros et al., 2008}), lo que convierte a este subproducto es una importante fuente de nitrógeno y elementos traza. Sumado a su alto contenido en polisacáridos, capacidad de retención de agua y porosidad, el BSG se propone como un medio de cultivo complejo apto para el crecimiento de microrganismos y producción de metabolitos de interés o de enzimas hidrolíticas (Xiros y Christakopoulos, 2012).

La Figura 2, presenta la efectividad hidrolítica de los tratamientos enzimáticos de Vizcozyme L (V) y Celluclast 1.5L (C) a diferentes dosis de enzimas. Se observa que a mayor dosificación se obtiene un efecto superior en la liberación de azúcares con respecto al tratamiento control. La aplicación de Viscozyme L genera una mayor respuesta en la sacarificación, en contraste a Celluclast 1.5L, el resultado confirma el requerimiento de un complejo enzimático apto para una matriz lignocelulósica. El análisis de varianza (ANOVA), indica que los factores dosis y tipo de enzima son estadísticamente significativos a un nivel de confianza del 95% (p ≤0.05). El máximo valor de glucosa obtenido fue de 16.5 g/L (313.5 mg/g BSG) para Viscozyme L, siendo un resultado superior al de otras investigaciones que presentaron tratamientos térmicos previos a la hidrólisis enzimática y que no incluyen tratamientos químicos o termo-mecánicos; ^{Macheiner et al. (2003}), reporta una concentración de glucosa de 150 mg/g BSG aproximadamente al aplicar Ceremix plus MG sobre BSG posterior a un pretratamiento microondas a 160 °C por 10 minutos. ^{Ravindran et al., 2018}, reporta azúcares reductores de 194 mg/g BSG, con un pretratamiento de steam explosión y posterior hidrólisis con celulasa y hemicelulasa.

Es importante mencionar que para la degradación de celulosa en monómeros de glucosa como unidades básicas se requiere de una acción sinérgica entre las enzimas exo-1,4-β-glucanasa, endo-1,4-β-glucanasa y la β-glucosidasa (^{De Vries y Visser, 2001}; ^{Van Dyk y Pletschke, 2012}). Las endoglucanasas realizan cortes al azar en el interior de la celulosa amorfa, generando oligosacáridos de varias longitudes y, en consecuencia, nuevos extremos de cadena. Las exoglucanasas actúan de una manera progresiva en los extremos reductores y no reductores de las cadenas del polisacárido, liberando glucosa o celobiosa. Las β-glucosidasas hidrolizan las celodextrinas solubles y la celobiosa a glucosa (^{Jeoh et al., 2017}). En consecuencia al utilizar un complejo de actividad celulasa se esperaba un resultado favorable, pero la baja efectividad de Celluclast 1.5L puede deberse a una posible limitación de accesibilidad al sustrato por el alto contenido de lignina, la presencia de inhibidores, por las características estructurales intrínsecas correspondientes al área superficial del residuo a procesar, grado de porosidad, cristalinidad o por características hidrofóbicas. La dosificación de Celluclast 1.5L sobre la cascarilla de cebada no genera un efecto significativo sobre la liberación de azucares reductores durante 5 horas de tratamiento a pH 5.0 y a 50 ºC.

Fig. 2: Efecto enzimático de Viscozyme L y Celluclast 1.5L sobre el proceso de sacarificación en la cascarilla de cebada cervecera. *Letras diferentes indican diferencia estadísticamente significativa entre las dosis de cada enzima (p ≤0,05). 

El tratamiento que corresponde a la aplicación secuencial de Celluclast 1.5L, Hemicelulasa y Xilanasa (C-H:X), se realizó con una dosis de Celluclast 1.5L de 42 U/g, seleccionada a partir de los resultados presentados en la Figura 2. La expectativa con las hemicelulasas y xilanasas se enfoca al alto contenido de hemicelulosa de la cascarilla de cebada. La hemicelulosa es un polímero no cristalino, con menor grado de polimerización que la celulosa, inferior a 200 monómeros, que presenta alto grado de ramificación (^{Cabeza et al., 2018}). Forma parte de la pared celular, recubriendo la superficie de las fibras de celulosa, a su vez los xilanos corresponden al componente mayoritario de la hemicelulosa (^{Zabed et al., 2016}). Así, las combinaciones de hemicelulasa y xilanasa se justifican por la presencia del sustrato.

Los resultados de los tratamientos C-H:X en las relaciones 10:5, 30:15, 50:25 U/g correspondientes a las denominaciones CHX1, CHX2 y CHX3, respectivamente, se presentan en la Figura 3. La máxima concentración de glucosa equivalente a 6.53 g/L se obtuvo para la aplicación CHX3. El análisis de varianza señala que la relación C-H:X presenta un efecto significativo en la respuesta con respecto al control (p ≤0.05). En C-H:X, la aplicación inicial de celulasa además de la hidrólisis generaría un efecto de modificación morfológica en el material lignocelulósico, es decir un incremento en el área superficial haciendo posible una mayor actuación secuencial de hemicelulasas y xilanasas en la matriz, junto con actividad celulasa residual. Al no presentarse una respuesta marcada en la generación de azúcares reductores con respecto a Viscozyme L, se intuye que en la primera etapa se puede presentar una inhibición por presencia de celobiosa y glucosa tanto para celulasas como hemicelulasas. El tiempo de tratamiento para celulasa fue de 5 horas en consecuencia una alternativa puede corresponder a una reducción en el tiempo de hidrólisis. Por otro lado, también se evalúa el efecto sinérgico de la enzima hemicelulasa con el complejo Viscozyme L (tratamiento H-V). La hemicelulosa se encuentra más disponible para una hidrolisis enzimática directa, posteriormente el complejo Viscozyme L que incluye actividades arabinasa, celulasa, β-glucanasa, hemicelulasa, y xilanasa, presentaría un efecto superior al obtenido, sin embargo el resultado no fue el esperado, y se puede correlacionar con una posible inhibición por producto causada por la primera acción de la enzima hemicelulasa. La combinación H-V reporta un valor inferior en 2.5 g/L unidades de glucosa al obtenido con Viscozyme L, siendo este último el complejo más idóneo para procesos hidrolíticos en materiales lignocelulósicos, y también ha sido reportado por otros investigadores (^{Duarte et al., 2004}).

Fig. 3: Efecto enzimático de los tratamientos C-H:X y H-V sobre el proceso de sacarificación en la cascarilla de cebada cervecera. *Letras diferentes indican diferencia estadísticamente significativa entre las dosis de cada enzima (p <0,05). 

En aplicaciones enzimáticas, es primordial optimizar procesos con el objeto de minimizar costos en relación a dosificación, materia prima y tiempo de procesos en función del máximo rendimiento o productividad, para este fin se realizan cinéticas enzimáticas. Así, para Viscozyme L se determinó el efecto del sustrato, acorde a los lineamientos de la cinética de Michaelis-Menten se debe garantizar saturación de las enzimas por el sustrato para alcanzar la velocidad máxima de una reacción. En la Figura 4a, se observa que la concentración de glucosa aumenta con respecto a la cantidad de sustrato con una pendiente marcada hasta 2.0 g para una posterior estabilización o un descenso a 2.5 g. Los parámetros cinéticos determinados por la linealización Lineweaver-Burk presentan valores de 2.98 g/L y 0.048g/L min correspondientes a Km y Vmax, respectivamente. Con respecto al tiempo, el tratamiento enzimático genera mayores resultados a medida que incrementa el tiempo del proceso con respecto al control K1 (BSG sin hidrolizar) y control K2 (solución buffer más dosis de enzima); a las 7 horas se obtiene un punto máximo de 16.90 g/L y posteriormente se aprecia un descenso a 14.61 g/L de glucosa que puede ser debido a inhibición por producto (Figura 4b).

Fig. 4: Hidrólisis enzimática Viscozyme L: a) Efecto del sustrato con 50 U/g dosis de enzima, b) Efecto del tiempo del tratamiento con 25 U/g dosis de enzima. 

Los pretratamientos fisicoquímicos son comúnmente empleados por el mayor rendimiento de azúcares reductores en comparación a los biológicos o enzimáticos. Sin embargo, de estos últimos se obtienen resultados promisorios al combinarlos con pretratamientos físicos y térmicos, siendo merecedores de un estudio adecuado para optimizar sus condiciones y así aplicarlos en un proceso final, limpio y eficiente del residuo agroindustrial. Diversos pretratamientos y combinaciones enzimáticas han sido reportados en la cascarilla de cebada como casos exitosos; ^{Macheiner et al. (2003}), destacan la hidrólisis con HCl (0.1 M) asistida con radiación microondas cuyo efecto incremento los azúcares reductores obteniéndose valores de 359.2 mg/g BSG en 10 minutos de hidrólisis a 160 °C. En otros pretratamientos incluyen reducción de tamaño de partícula y extrusión húmeda en dos ciclos a 160 °C. Posteriormente tras la aplicación de CelluPract AL7 reportaron la obtención 160 mg/g BSG de azucares reductores. En contraste, ^{Pierre et al., (2011}), obtuvieron 240 mg/g BSG de azúcares reductores con un pretratamiento termomecánico a 163 °C seguido de hidrólisis con Celluclast 1.5L.

El pretratamiento térmico permite una alteración estructural de los biopolímeros que luego se reorganizan permitiendo un mejor acceso de las enzimas hidrolíticas a los enlaces glucosídicos (^{Macheiner et al., 2003}). La reducción del tamaño de partícula mejora el rendimiento de la hidrólisis de celulosa; la molienda aumenta las regiones amorfas de la celulosa (^{Zhao et al., 2006}). Además, la degradación mecánica expone las partes internas del grano, cuyas paredes celulares son más fáciles de hidrolizar. Esto aumenta la cantidad de carbohidratos solubles en agua y mejora la velocidad de reacción inicial (^{Niemi et al., 2012}). En cuanto a la hidrólisis con ácidos y álcalis diluidos, pueden ser beneficiosos para mejorar el rendimiento de glucosa durante la hidrólisis de celulosa al eliminar parcialmente la fracción de hemicelulosa y lignina, pero implica lavados secuenciales sobre el material hidrolizado para eliminar subproductos y evitar efectos inhibidores en la reacción enzimática o en la fermentación (^{Mussatto et al, 2008}). Según los resultados alcanzados en esta investigación, la estrategia implementada avala la combinación de los pretratamientos físico, térmico y enzimático como una metodología apta para la obtención de azúcares fermentables, sin comprometer los compuestos generados para futuras fases del bioproceso.

CONCLUSIONES

Con el procedimiento desarrollado se espera maximizar la liberación de azúcares reductores a partir de la cascarilla de cebada cervecera evaluando las condiciones de concentración de sustrato, dosis de enzima y tiempo de hidrólisis. El pretratamiento térmico y la molienda han facilitado la reacción de las diferentes aplicaciones enzimáticas. El máximo valor de glucosa obtenido fue de 16.90 g/L (equivalente a 321.11 mg/g BSG). Las condiciones óptimas de este resultado fueron halladas para el complejo enzimático Viscozyme L con una dosis de 25 U/g, pH 5.0, 50 °C, tiempo de hidrólisis 7 horas y una consistencia de BSG del 5% p/v.

El aprovechamiento de la cascarilla de cebada cervecera para la obtención de bioetanol es factible a través de sacarificaciones enzimáticas que incluyan complejos enzimáticos. Para un mayor rendimiento de azúcares reductores, se deben evaluar otros tratamientos biológicos más específicos que degraden la matriz lignocelulósica, como es el caso de la lignina y la pectina que obstaculizan la hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa. La sinergia e interacción de los complejos enzimáticos y/o sistemas biológicos deben ser evaluados en función de potenciar el rendimiento de azúcares fermentables y la eficiencia del proceso.