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Ciencia e investigación agraria

On-line version ISSN 0718-1620

Cienc. Inv. Agr. vol.34 no.3 Santiago Dec. 2007

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-16202007000300007 

 

Cien. Inv. Agr. 34(3): 231-236. 2007
www.rcia.puc.cl

NOTA DE INVESTIGACIÓN

 

Desinfección de cariopses y regeneración de plantas de Spartina argentinensis

Cariopsis disinfection and plant regeneration of Spartina argentinensis

 

Midan S. Bueno1, Susana R. Feldman 1,2 y Juan P. Ortiz3

1Cátedra de Biología, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario, C.C. 14, s2125zaa Zavalla, Argentina.
2
Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Rosario (CIUNR).
3
Cátedra de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).


Abstract

A protocol for disinfection and in vitro regeneration of Spartina argentinensis was developed. The lowest percentage of contamination was obtained after treating caryopses with 90° ethanol for 60 s and 20 min immersion in 2.5% sodium hypochlorite (NaOCl) plus 0.1% Tween 20. Murashige and Skoog (MS) media was used for callus induction, supplemented with 0.5 mg•L-1 of 2, 4 dichlorophenoxy acetic (2,4-D) and 1 mg•L-1 of indole-3-acetic acid (IAA). The highest proportion (20%) of shoot regeneration was achieved with MS media plus 0.25 mg•L-1 of bencyl aminopurine (BAP), whereas 0.5 mg•L-1naphtalenacetic acid (NAA) was used for root induction. Plants were regenerated via organogénesis. To our knowledge, this is the first report of a protocol for in vitro plant regeneration of S. argentinensis, and it is the initial stage required for obtaining somaclonal variations.

Key words: In vitro regeneration, organogénesis, Spartina.

Resumen

Se desarrolló un protocolo de desinfección y regeneración in vitro de Spartina argentinensis. El menor porcentaje de contaminación se obtuvo tratando los cariopses por 60 s en etanol 90° y 20 min de inmersión en hipoclorito de sodio al 2,5% con Tween 20. La inducción de callos se realizó en medio Murashige y Skoog (MS) suplementado con 0,5 mg•L-1 de ácido diclorofenoxi acético (2,4-D) y 1 mg•L-1 de ácido indol acético (AIA). La mayor (20%) regeneración de vastagos se logró con igual base salina y 0,25 mg•L-1 de bencilamino purina (BAP). Se utilizó 0,025 mg•L-1 de ácido naftalen acético para la regeneración de raíces. Las plantas se regeneraron vía organogénesis. Este protocolo es la primera mención de regeneración de plantas de S. argentinensis utilizando cultivo in vitro y constituye la etapa inicial para obtener variantes somaclonales. La metodología de desinfección se puede hacer extensiva a otras especies.

Palabras clave: Organogénesis, regeneración in vitro, Spartina.


Introducción

El espartillo, Spartina argentinensis Parodi (Poaceae: Chloridaeaé), es una de las especies dominantes de las comunidades halófilas de distintas áreas de Argentina. Forma matas de altura variable, de 0,5 - 1,4 m de altura. Aunque produce abundantes panojas durante el verano, se reproduce principalmente en forma agámica por rizomas (Feldman, 2003).

Los espartillares se utilizan para cría de ganado vacuno, a pesar del alto grado de lignificación de sus hojas, lo que reduce la digestibilidad. La obtención de líneas de espartillo caracterizadas por un menor contenido de lignina es una de las alternativas para mejorar la digestibilidad del forraje y al mismo tiempo mejorar la oferta forrajera en las áreas dónde esta especie se encuentra presente.

Estudios previos (Larkin y Scowcroft, 1981) demostraron que durante las sucesivas mitosis que se producen en cultivo in vitro pueden ocurrir importantes modificaciones genéticas en las células. Algunas se manifiestan como mutaciones heredables, generando variaciones somaclonales. Por consiguiente, el cultivo de tejidos es una herramienta útil para el mejoramiento de especies vegetales y se ha utilizado en especies forrajeras nativas (Echenique et al, 2001; Kothari et al, 2005).

La elección del explante es fundamental para el establecimiento de un cultivo in vitro (Roca y Mroginsky, 1991). En gramíneas se ha regenerado plantas utilizando embriones inmaduros, inflorescencias inmaduras y cariopses maduros (Dutta Grupta et al, 1999; Echenique et al, 2001). Sin embargo, algunos de estos explantes sólo se pueden obtener en determinadas épocas del año. En el género Spartina, se ha logrado regenerar plantas a partir de cultivo in vitro de cariopses maduros (Li et al., 1995, Li and Gallager, 1996; Wang et al., 2003). Sin embargo, en S. argentinensis, la contaminación de sus cariopses por Alternaría altérnala, Fusarium graminearum y Bipolaris sorokiniana y otros hongos dificulta la utilización de los mismos para iniciar los cultivos. Algunos de estos hongos se han descrito como endógenos (Feldman et al., 2004). Este trabajo tuvo como objetivo estudiar diferentes tratamientos de desinfección de cariopses de espartillo (S. argentinensis) y evaluar su potencial de regeneración in vitro.

Materiales y métodos

Se trabajó con cariopses maduros de S. argentinensis, sin palea ni lemma, extraídos de panojas cosechadas en un espartillar ubicado en Pérez, provincia de Santa Fe, Argentina (32° 45' S; 60° 35' W). Se realizaron dos experimentos de desinfección de cariopses: 1. Inmersión durante 20 min en hipoclorito de sodio NaOCl al 1,5 y 2,5% (v/v) (Cloro Argentina S.A., 5,5 g•L-1 de cloro) con o sin el agregado de Tween 20 (0,1%). 2. Inmersión en NaOCl 2,5% con Tween 20 (0,1%) durante 20 o 30 min a temperatura ambiente con o sin inmersión en etanol 90° por 60 s. Se utilizaron cinco repeticiones por tratamiento, con 20 cariopses por repetición. Luego de cada tratamiento, los cariopses se lavaron con abundante agua estéril y se los sembró en placas de Petri con medio Murashigue Skoog (MS 1962), sin hormonas, suplementados con 30 g•L-1 de sacarosa, 7 g•L-1 de agar, pH 5,8. Los cultivos se incubaron en oscuridad a 23 + 2°C durante 30 días.

La proporción de cariopses contaminados a los 7 días de la siembra in vitro se evaluó mediante análisis de varianza (ANDEVA) y los promedios se separaron según Duncan (Statistica 5.0). Previo a los análisis, los valores porcentuales se transformaron en arcoseno √x.

Los cariopses libres de contaminación se transfirieron a tubos de ensayo de 20 mi con diferentes medios para la inducción de callos (Cuadro 1) y se mantuvieron en oscuridad a 25° C, durante 30 días. Los callos producidos se repicaron a medios para la inducción de vastagos con diferentes concentraciones de bencil amino purina (BAP) y se incubaron a 25° C, con un fotoperíodo de 16 h (Cuadro 1). Los vastagos obtenidos se separaron y la regeneración de raíces se obtuvo en medio con ácido naftalen acético (ANA) (Cuadro 1).


Las frecuencias de formación de callos y vastagos páralos distintos medios ensayados, se compararon mediante prueba de homogeneidad con aplicación de Chi cuadrado (A,2) (SAS Institute, Cary, NC, EUA).

Se realizaron estudios histológicos para determinar la vía de regeneración de los explantes. Las muestras se fijaron en FAA (10% formol, 5% ácido acético, 50% etanol y 35% agua) y posteriormente se deshidrataron en concentraciones ascendente de etanol (1 h en cada una de las siguientes soluciones de etanol: 70°; 80°; 90°, 96° y 30 min en 100°). Previo a la inclusión en parafina, las muestras se clarificaron con xilol, realizando un paulatino desplazamiento del etanol 100° por el xilol. Se realizaron cortes con micrótomo tipo Minot (18-20 µm de espesor) y se colorearon con safranina (30 min) y fast-green (60 s), que tiñe de color azul-verdoso las zonas celulósicas y de color fucsia a las zonas lignificadas (Johansen, 1940, Dizeo de Strittmater, 1979). Los preparados montados con bálsamo de Canadá, se observaron y se fotografiaron con microscopio óptico.

Resultados y discusión

La desinfección de los explantes con NaOCl más 0.1% de Tween 20 como humectante disminuyó significativamente (p = 0,001) la contaminación a los 7 días de incubación. No hubo respuesta diferencial a las concentraciones de NaOCl, posiblemente debido al marcado efecto del humectante que permitió una eficiente desinfección aún con la menor concentración de NaOCl (Figura 1).


La contaminación disminuyó significativamente (p < 0,05) en función del tiempo de inmersión en NaOCl y con el tratamiento con etanol, sin manifestarse interacción entre las variables analizadas (Figura 2). A diferencia de reportes previos, los mejores resultados se obtuvieron utilizando una mayor concentración de etanol 90° (Li y Gallagher, 1996). Posiblemente esto se debió a que los cariopses de S. argentinensis presentan mayor contaminación fúngica (Feldman et al, 2004).


La presencia de callos se observó a los 7 días de incubación de los explantes en los medios de inducción. En la Figura 3 se observa la evolución porcentual de producción de callos durante los primeros cuarenta días de cultivo. La obtención de callos fue máxima a los 30 días de iniciado el cultivo, estabilizándose posteriormente. No se detectaron diferencias estadísticas significativas en las frecuencias de inducción de callos entre los medios MI y M2 (68,8 y 62,5% respectivamente), respuesta coincidente con los resultados obtenidos previamente para S. alterniflora (Wang et al, 2003). La inducción de callos sólo alcanzó a 37,5% en el medio 3, que incluyó 0,5 mg•L-1 de 2,4-D y 0,05 mg•L-1 de BAP, debido a la ausencia de ANA o AIA.



Los estudios histológicos mostraron que la regeneración de vastagos ocurrió vía organogénesis, donde se observa la formación de dos vastagos dentro de la masa del callo, sin zonas embriogénicas ni proembriones (Figura 5).


La misma vía de regeneración de vastagos fue previamente informada para S. alterniflora, S. cynosuroides y S. patens (Wang et al., 2003; Li et al., 1995, 1996). En otras especies, ej. Eragrostis curvula, y utilizando el mismo explante, la regeneración de vastagos ocurrió vía embriogénica (Echenique et al., 2001) y en Bouteloua gracilis, la regeneración de vastagos se produjo tanto por vía organogénica como embriogénica (Agudo-Santacruz et al., 2000).

De las concentraciones hormonales utilizadas para la regeneración de vastagos, el medio V2 con 0,5 mg•L-1 de BAP favoreció la mayor respuesta de los explantes, puesto que 20% de los callos regeneraron vastagos. En el medio VI, con 0,25 mg•L-1 de BAP, los porcentajes de respuestas fueron inferiores a 12%. Si bien el porcentaje de callos que regeneraron vastagos fue bajo, cada callo diferenció múltiples vastagos, aumentando la eficiencia de regeneración.

La regeneración de raíces se indujo favorablemente con 0,50 mg•L-1 de ANA. Las plantas regeneradas se separaron y se transfirieron a una mezcla de suelo (30% vermiculita-70% tierra) en invernadero.

La metodología de desinfección de cariopses estudiada se podría extender a otras especies que presenten altos porcentajes de contaminación fúngica, debido a que permite utilizar el tratamiento combinado de NaOCl y etanol, que presentan baja toxicidad, a diferencia de otros que utilizan cloruro de mercurio (Wang et al., 2003).

Este trabajo es la primera mención de regeneración de plantas de S. argentinensis utilizando cultivo in vitro de cariopses maduros y constituye la etapa inicial para la obtención de variantes somaclonales. De esta forma se espera poder obtener líneas mejoradas en busca de cultivares con una mejor aptitud ganadera. Del mismo modo, estos protocolos de regeneración pueden aplicarse a otras especies de gramíneas, comunes en pastizales naturales.

 

Literatura citada

Agudo-Santacruz, G., J.L. Cabrera-Ponce, V. Olalde-Portugal, M. Sánchez-González, Márquez-Guzmán, and L. Herrera-Estrella. 2001. Tissue culture and plant regeneration of blue Grama grass, Bouteloua gracilis (H.B.K.) Lag. Ex Steud. Plant 37:182-189.        [ Links ]

Dizeo de Strittmater, C.1979. Modificación de una técnica de coloración safranina- fast green. Bol. Soc. Arg. Botánica 18:121-122.        [ Links ]

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Recibido 13 junio 2007. Aceptado 05 septiembre 2007.

1 Dirigir correspondencia a M. S. Bueno: mbueno@unr.edu.ar

 

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