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Latin american journal of aquatic research

On-line version ISSN 0718-560X

Lat. Am. J. Aquat. Res. vol.42 no.3 Valparaíso July 2014

 

Short Communication

 

Evaluación de la bioacumulación de cobre en Euglena gracilis mediante la técnica de fluorescencia de rayos X

Assessment of copper bioaccumulation in Euglena gracilis by X-Ray fluorescence technique

 

David Cervantes-Garcia1, Jose Luis Rubalcaba-Sil2, Daniel Gonzalez-Mendoza1 & Mónica Avilés-Marín1

1Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Baja California (ICA-UABC). Carretera a Delta s/n, C.P. 21705, Ejido Nuevo León, Baja California, México
2Instituto de Física, Universidad Nacional Autónoma de México, Edificio Colisur, Cubículo FE-11. Circuito de la Investigación Científica s/n, Ciudad Universitaria Delegación Coyoacán
04510 Ciudad de México, México
Corresponding author: Daniel González-Mendoza (daniasaf@gmail.com)


RESUMEN. En esta investigación se evaluó el efecto de la exposición de cobre en la capacidad de bioacumulación de metal en células de Euglena gracilis. La acumulación de metal medida con la técnica de fluorescencia de rayos X (XRF) mostró que la acumulación de Cu+2 en E. gracilis fue dosis dependiente y se incrementó significativamente en las células tratadas con 0.4 y 0.8 mM de Cu+2 con respecto al control. No se descarta la presencia de una estrategia de acumulación en E. gracilis que podría involucrar la participación de una serie de múltiples procesos, como producción de vacuolas. Futuros estudios al respecto deberán orientarse a evaluar la capacidad de bioacumulación de E. gracilis para su aplicación en programas de biorremediación de sistemas acuáticos.

Palabras clave: Euglena gracilis, XRF, cobre, contaminación, tolerancia, ecotoxicología.


ABSTRACT. The effect of the exposure to copper in metal bioaccumulation capacity in cells from Euglena gracilis was evaluated in this study. Metal accumulation measured with the X-ray fluorescence (XRF) technique showed that the accumulation of Cu+2 in E. gracilis was dose dependent and was significantly increased in cells treated with 0.4 and 0.8 mM of Cu+2 with respect to control. The presence of an accumulation strategy in E. gracilis that could involve the participation of a number of multiple processes, such as production of vacuoles, is not discarded. Future studies should be oriented to evaluate the potential for bioaccumulation of E. gracilis to be applied in bioremediation of aquatic systems programs.

Keywords: Euglena gracilis, XRF, copper, pollution, tolerance, ecotoxicology.


 

En el mundo muchas zonas de desarrollo urbano se encuentran cerca de los ecosistemas costeros, los cuales se pueden ver afectados por efluentes de origen industrial, actividades portuarias y de la escorrentía urbana que, a menudo, contiene altas concentraciones de metales potencialmente tóxicos (Cuong et al., 2005; Garcia et al., 2013). Dada su presencia y persistencia en ambientes acuáticos, los elementos potencialmente tóxicos (EPT) son un grupo de contaminantes que se evalúa con frecuencia (Johnston & Roberts, 2009). En este sentido, el cobre (Cu+2) es un micronutriente esencial para los vegetales y a menudo se encuentra en altas concentraciones en ecosistemas acuáticos (Chen et al., 2007). Un exceso de este metal puede estimular la formación de radicales libres de especies reactivas de oxígeno y generar estrés oxidativo en el organismo, causando efectos nocivos en la estructura celular (González-Mendoza et al., 2009). Lo anterior ha motivado el uso de organismos modelo, que permitan la evaluación rápida de EPT en ecosistemas acuáticos. Para la selección de microorganismos empleados en la eliminación de iones metálicos se considera su tasa de crecimiento, nivel de tolerancia a EPT y concentración de EPT en el medio (Garbisu et al., 2002). En este sentido, Euglena sp. es un organismo ampliamente estudiado ya que tiene la capacidad de crecer en ambientes acuáticos que poseen altas concentraciones de diferentes metales (Rehman, 2011). Adicionalmente, E. gracilis puede ser una alternativa ecotoxicológica para usarlo como indicador de contaminación en medios acuáticos (Ahmed & Häder, 2010). Esto involucra el uso de técnicas de determinación rápida de la capacidad de bioacumulación de los microorganismos cuando se desarrollan en un ambiente con metales.

La técnica de fluorescencia de rayos X (XRF), representa una alternativa viable, ya que es una poderosa técnica de análisis instrumental multi-elemental no destructiva de alta sensibilidad (ppm), que se basa en la detección de rayos X característicos emitidos por los átomos de una muestra irradiada por un haz primario de rayos X, generalmente producido en un tubo de rayos X de molibdeno o rodio (Ruvalcaba et al., 2010). Sin embargo, a pesar que la técnica de XRF ha sido aplicada al estudio de acumulación de metales por plantas (Tsutsumimoto & Tsuji, 2007), actualmente no hay información disponible sobre su aplicación en microorganismos como E. gracilis expuestos al cobre. Por otra parte, aún cuando estudios recientes han abordado el estudio de la respuesta fisiológica de E. gracilis a diferentes dosis de cobre (García-Cervantes et al., 2011), su capacidad de bioacumulación como mecanismo de protección de la célula al ser expuesta a diferentes dosis de cobre ha sido poco estudiada. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de bioacumulación mediante la técnica de XRF y la respuesta antioxidante en células de Euglena gracilis expuestas a diferentes dosis de cobre.

Se realizaron experimentos empleando cultivos axénicos de E. gracilis cepa Z (Carolina Biological Supply®). El experimento consistió en realizar el crecimiento del microorganismo en un medio de cultivo mínimo con la siguiente formulación: acetato de sodio (1 g L-1), extracto de carne (1 g L-1), triptona (2 g L-1), extracto de levadura (2 g L-1) y CaCLH2O2 (10 mg). Los experimentos se realizaron inoculando 2x105 células obtenidas de la fase exponencial (seis días de crecimiento) en matraces de 1 L con dosis de 0; 0,4; y 0,8, dosis menor y mayor a la dosis letal media de sulfato de cobre previamente obtenida (0,6 mM). Los matraces se mantuvieron bajo luz blanca fría continua con intensidad lumínica de 90 ± 10 µmol m-2 s-1, a temperatura de 24 ± 2°C y agitación manual dos veces al día. A los tres días después de la exposición con cobre la biomasa fue obtenida por centrifugación (1000 x g para 10 min en 10°C) y fue resuspendida en una solución de EDTA 0,02 M disuelta con agua bidestilada y desionizada (el lavado con EDTA extrae el cobre adsorbido a la superficie celular). Las células permanecieron en esta solución durante 3 min, posteriormente se centrifugaron y se descartó el sobrenadante. Posteriormente, la biomasa de cada tratamiento fue secada y liofilizada, para su almacenamiento a temperatura ambiente en un desecador hasta su posterior uso.

El análisis multielemental directo de las muestras se efectuó mediante el equipo de XRF SANDRA (Sistema de análisis no destructivo por rayos X) del Instituto de Física de la Universidad Nacional Autónoma de México (Ruvalcaba et al., 2010). Para el análisis de las muestras se tomaron 300 mg de biomasa liofilizada de cada tratamiento y se comprimió, hasta formar una pastilla de 0,5 a 1,0 cm de diámetro. Para el análisis de las muestras con la técnica XRF, se empleó un haz de rayos X de molibdeno de 1 mm de diámetro, con potencial de 35 keV y 0,2 mA en el tubo. Cada irradiación duró en promedio 10 min. La detección de rayos X se realizó con un detector Si-PIN Amptek a 45° del haz primario de rayos X, y normal a la superficie de la muestra. Para la calibración del sistema y el análisis cuantitativo, se irradió bajo las mismas condiciones referencias certificadas de diversos materiales biológicos del National Institute for Standards and Technology (NIST) SRM 1573a (hojas de tomate), y la Agencia Internacional de Energía Atómica (AIEA) SRM 16 (acelga), SRM 392 (alga), SRM 286 y SRM 336 (líquenes), y SRM 359 (col), estos últimos usualmente empleados en estudios con biomonitores con técnicas de rayos X patrocinados por la AIEA (Cervantes et al., 2008). La intensidad de rayos X de los elementos detectados en las muestras se midió con el programa AXIL (Vekemans et al., 1994) y el análisis cuantitativo se realizó siguiendo el procedimiento descrito por Rousseau et al. (1996). La absorción de los iones de Cu2+ en los tejidos de E. gracilis, se calculó usando el factor de bioacumulación (FBA) que proporciona información sobre la habilidad del vegetal de acumular metales con respecto a la concentración de metales presentes en la solución nutritiva. El FBA se determinó usando la siguiente fórmula:

FBA = [Cu2+] [Cu2+]0-1

donde [Cu2+] es la concentración de cobre en la biomasa de Euglena (ppm) y [Cu2+]0 es la concentración inicial del metal adicionado a la solución nutritiva (ppm).

El experimento se realizó al azar con tres repeticiones. Las diferencias significativas entre las muestras tratadas y control fueron analizadas usando la prueba de Kruskal-Wallis (Statistical Package version 5.5, Statsoft, USA). En la Figura 1 se muestra los espectros típicos de fluorescencia de rayos X para una muestra y las concentraciones de Cu2+ en solución, donde se observó un incremento en la intensidad de los rayos X de Cu2+ conforme se incrementó la dosis de metal. Los resultados de acumulación del Cu2+ en las células de E. gracilis tratadas con respecto al control mostraron diferencias significativas entre los tratamientos de 0,4 y 0,8 mM de cobre (P = 0,0273). A medida que se incrementó la dosis de cobre de 0,4 mM a 0,8 mM se observó una mayor acumulación de metal en la biomasa de E. gracilis con respecto al control, de 6000 a 12000 ppm, respec-tivamente (Fig. 2). Con respecto al factor de bioacumulación (FBA), los resultados indicaron que E. gracilis tiene un FBA alto, que puede incrementarse a medida que se duplica la dosis de metal presente en el medio de cultivo (Tabla 1).

 

Figura 1. Espectros de fluorescencia de rayos X de Euglena gracilis en función de la dosis de cobre en solución.

 

Figura 2. Concentración de cobre (ppm) determinada por la técnica de XRF en células de Euglena gracilis expuestas a diferentes concentraciones de Cu2+ en medio de cultivo durante 72 h. Los bloques muestran la mediana, 25 y 75%, las barras indican los valores mínimo y máximo, n = 3.

Tabla 1. Factor de bioacumulación de Euglena gracilis a dosis de cobre. Medias con diferentes letras en la misma columna son estadísticamente diferente a P = 0,05. Los resultados con medias de tres réplicas por tratamiento.

 

Siguiendo el criterio de Brooks (1998), quien clasifica como hiper-acumuladores a los organismos que presentan más de 1000 ppm de metal(es) en sus tejidos. En base a estos resultados, se puede señalar que E. gracilis es un organismo hiper-acumulador de Cu2+ dadas las altas concentraciones detectadas en su biomasa. Además, estos resultados indican la presencia de una estrategia de acumulación que podría involucrar la participación de múltiples procesos, tales como la producción de vacuolas (Einicker-Lamas et al., 2002). Por otra parte, no se descarta la presencia de ligandos de alta afinidad, por ejemplo es posible que estén presentes proteínas como la fitoquelatin sintetasa. Ésta es una proteína rica en cisteína (γ-glutamilcisteína (γ-Glu-Cys) dipeptidil transpectidasa), que se localiza en el citoplasma donde participa en la síntesis de las fitoquelatinas (FQs) a partir del glutatión (GSH) y en presencia de ciertos metales (Loscos et al., 2006).

Futuros estudios deben encaminarse a determinar la presencia de enzimas antioxidantes en células de E. gracilis tratadas con metales esenciales. E. gracilis es un organismo hiper-acumulador de Cu2+ dadas las altas concentraciones detectadas en su biomasa. Además, la técnica de XRF mostró una gran ventaja ya que gracias a su sensibilidad y la notable acumulación de Cu es factible evaluar directamente su presencia empleando una baja cantidad de biomasa y escaso consumo de insumos. No se descarta la presencia de una estrategia de acumulación en E. gracilis que podría involucrar la participación de múltiples procesos, tales como la producción de vacuolas o compuestos quelatantes.

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el financiamiento de esta investigación mediante el proyecto No 79234. Así como al Instituto de Física de la Universidad Nacional Autónoma de México por las facilidades recibidas para la realización del estudio.

 

REFERENCIAS

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Received: 7 October 2013; Accepted: 30 June 2014.

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