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Latin american journal of aquatic research

versión On-line ISSN 0718-560X

Lat. Am. J. Aquat. Res. vol.44 no.4 Valparaíso set. 2016

http://dx.doi.org/10.3856/vol44-issue4-fulltext-23 

Short Communication

 

Genotipificarión y relación hospedador-específica del virus de la necrosis pancreática infecciosa en Chile

Genotyping and host-specific relationship of infectious pancreatic necrosis virus in Chile

 

Pamela Torres1, Yoanna Eissler1, David Tapia2, Juan Carlos Espinoza1 & Juan Kuznar1

1 Centro de Investigación y Gestión de Recursos Naturales Instituto de Química y Bioquímica Facultad de Ciencias Universidad de Valparaíso, Valparaíso, Chile
2
Doctorado en Acuicultura, Programa Cooperativo Universidad de Chile Universidad Católica del Norte, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Chile
Corresponding author: Yoanna Eissler (yoanna.eissler@uv.cl)
Corresponding editor: Sandra Bravo


RESUMEN. Se analizaron muestras de órganos (riñón y bazo) de las principales especies de salmónidos cultivados en Chile a través de la reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR anidado) para detectar la presencia del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV). La técnica resultó ser eficiente y sensible, permitiendo amplificar material genético del virus para su secuenciación directamente desde los tejidos, incluso desde muestras que no pudieron ser aisladas en cultivo celular. A través del análisis filogenético se detectaron los dos genogrupos descritos previamente en el país, i.e., europeo (Genogrupo 5) y americano (Genogrupo 1), siendo cuantitativamente predominantes los IPNV del Genogrupo 5 (78,8%). Dentro del Genogrupo 1, se observó claramente la formación de un sub-grupo de virus chilenos separados de las cepas de referencia (e.g., WB, VR-299), por lo que se propone su denominación como genotipo chileno. Adicionalmente, se observó una relación estadística-mente significativa hospedador-específica entre los genogrupos identificados: los virus del Genogrupo 5 provienen de Salmo salar mientras que los del Genogrupo 1 provienen de Oncorhynchus mykiss u O. kisutch (P < 0,001). La asociación de esta relación hospedador-específica con la virulencia puede proveer información importante para el manejo y control de IPNV en Chile.

Palabras clave: virus, IPNV, PCR anidado, genotipificación, filogenia, relación hospedador-específica, gen VP2.


ABSTRACT. Samples of fish organs (kidney and spleen) from the main salmonid species farmed in Chile were analyzed through the nested polymerase chain reaction (nested PCR) to detect the presence of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV). The technique proved to be efficient and sensitive, allowing amplification of viral genetic material for sequencing directly from tissue, even from samples that could not be isolated in cell culture. The phylogenetic analysis showed the two genogroups previously described in the country, i.e., European (Genogroup 5) and American (Genogroup 1), being the IPNV that belong to Genogroup 5 the dominant one (78.8%). It is clear that the Chilean IPN viruses are clustered within the Genogroup 1 forming a sub-group that is separated from the reference strains (e.g., WB, VR-299), hence we propose its denomination as a Chilean genotype. Additionally, a statistically significant host-specific relationship was observed between the genogroups identified: viruses from Genogroup 5 were detected in Salmo salar, while the ones from Genogroup 1 were detected in Oncorhynchus mykiss or O. kisutch (P < 0.001). The association of this host-specific relationship with the virulence can provide important information for the management and control of IPNV in Chile.

Keywords: virus, IPNV, nested PCR, genotyping, phylogeny, host-specific relation, VP2 gene.


 

El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) es el agente causante de la necrosis pancreática infecciosa (IPN), enfermedad que afecta principalmente a salmónidos cultivados en condiciones de producción intensiva. Se le atribuyen mortalidades en la fase de alevín de hasta el 100% y de 10 a 20% en post-smolts luego de su traspaso a jaulas en el mar (Evensen & Santi, 2008).

La enfermedad presenta alta prevalencia y se encuentra diseminada en la mayoría de los países donde se cultivan salmones (Munro & Midtlyng, 2011). En Chile, el primer reporte y caracterización del virus se realizó en 1984 (McAllister & Reyes, 1984; Espinoza et al., 1985); sin embargo, pasaron varios años hasta que se constató la presencia de la enfermedad en 1998 (Taud & Palacios, 2003). Desde entonces, la enfermedad se extendió rápidamente por las diferentes áreas de cultivo del país, afectando principalmente a alevines de salmón del Atlántico (Salmo salar), aunque también ha sido reportada en trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y salmón coho (Oncorhynchus kisutch) (SERNAPESCA, 2015). Actualmente, IPN es considerada endémica y prevalente en Chile, y según los últimos informes sanitarios publicados por el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura (SERNA-PESCA), el virus IPN es uno de los patógenos detectado con mayor frecuencia por laboratorios de diagnóstico y una de las principales causas de mortalidad por enfermedades prevalentes que afectan a salmones (SERNAPESCA, 2013, 2014b, 2015).

El IPNV pertenece al género Aquabirnavirus, cuyos integrantes se caracterizan por tener un genoma ARN de doble cadena, que consta de dos segmentos, A (3.097 pb) y B (2.787 pb) (Dobos, 1995). El segmento A posee dos marcos de lectura abierta (ORF) superpuestos: el más grande codifica para una poli-proteína de 106 kDa en el orden NH2-pVP2-NS-VP3-COOH y el más pequeño codifica para un polipéptido rico en arginina, conocido como VP5 (Duncan et al., 1987; Dobos, 1995). Por otro lado, el segmento B codifica para el polipéptido VP1 de 94 kDa que corresponde a la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp). Esta proteína se encuentra presente en dos formas: como un polipéptido libre o unido covalentemente al extremo 5' de los dos segmentos del ARN genómico (VPg) (Dobos, 1995).

Actualmente los Aquabirnavirus se clasifican en base a la secuencia de la región codificante de la proteína VP2 en 8 genogrupos. La primera clasificación filogenética fue propuesta por Blake et al. (2001), donde se describió la presencia de 6 genogrupos, compuestos por diferentes cepas de origen europeo, americano y asiático. Posteriormente, Nishizawa et al. (2005) revelaron la existencia de un séptimo genogrupo integrado únicamente por cepas japonesas, y recientemente en Australia se aisló un nuevo Aquabirnavirus desde trucha arcoíris, que fue clasificado en un octavo genogrupo (McCowan et al., 2015; Mohr et al., 2015). En Chile, los virus IPN que han sido caracterizados genéticamente pertenecen a los Genogrupos 1 y 5, i.e., norteamericanos y europeos, respectivamente (Eissler et al., 2011; Mutoloki & Evensen, 2011; Calleja et al., 2012; Tapia et al., 2015; Jorquera et al., 2016), dentro de los cuales forman sus propios subtipos o subgrupos (Tapia et al., 2015). Sin embargo, existe muy poca información acerca de la predominancia de cada uno de estos genogrupos y su interacción con las distintas especies hospederas de salmónidos cultivadas en el país.

La reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR anidado) ha probado ser una técnica de detección rápida y sensible para el IPNV (Rimstad et al., 1990; López-Lastra et al., 1994; Barlič-Majanga et al., 2002; Cutrín et al., 2005), ya que permite amplificar y concentrar el material genético del virus y detectarlo aun en casos en que los títulos virales son muy bajos (Alonso et al., 1999). Debido a esto, la técnica puede ser utilizada para la amplificación y posterior secuenciación de un segmento del genoma del IPNV directamente desde muestras de tejidos de peces, sin la necesidad de realizar el aislamiento en cultivo celular de los virus, acortando considerablemente el tiempo para su genotipificación.

El objetivo de este trabajo es realizar la genotipificación de virus IPN, directamente a partir de muestras de órganos de salmónidos, para determinar la predominancia de cada uno de los genogrupos identificados y establecer si existe una relación hospedador-específica entre estos genogrupos y las especies de salmónidos cultivados en Chile.

Para esto, se tomaron muestras de órganos (riñón y bazo) de peces salmónidos de las tres especies cultivadas en el país y se fijaron en etanol al 95%. Las muestras fueron colectadas entre noviembre 2009 y agosto 2015, en 19 localidades diferentes, tanto de centros de agua dulce como de mar, y corresponden a mortalidad fresca (código CUP) o de centros en los cuales previamente se registró mortalidad por IPN. Muestras con el mismo código fueron colectadas en el mismo centro o piscicultura (Tabla 1).

 

Tabla 1. Información de las muestras de virus IPN utilizadas en este estudio.
*Virus reportados en el trabajo de Tapia et al. (2015).

 

En el laboratorio, los órganos fijados fueron homogeneizados con un mortero en PBS tampón 1X, pH 7,2 y centrifugados a 2.000 g por 15 min a 4°C en una centrífuga MIKRO 22R (Hettich zentrifugen). Posteriormente, se extrajo el sobrenadante para luego ser almacenado a -20°C hasta el momento de su análisis.

La extracción del ARN viral se realizó directamente desde el homogeneizado de tejido. Se tomó un total de 720 μL del homogeneizado de cada muestra y se extrajo el material genético utilizando el kit E.Z.N.A.™ Total RNA Kit I (OMEGA biotek) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN total extraído fue determinada mediante la medición de absorbancia a 260 y 280 nm usando el espectrofotómetro MaestroNano® (Maestrogen). Las muestras cuya concentración fue >10 ng ARN total μL-1 fueron diluidas en proporción de 1:10, mientras que las que presentaron una concentración >100 ng de ARN total μL-1 fueron diluidas a razón de 1:100.

Una vez obtenido el material genético se amplificó una región de 1.180 pb del gen de la proteína VP2 mediante la técnica de RT-PCR utilizando el equipo PCR Multigene (Labnet). Para esto, se mezclaron 3 μL de ARN viral con los partidores A1F (5'-TGAGA TCCATTATGCTTCCAGA-3') y A2R (5'-GACAG GATCATCTTGGCATAGT-3') (Blake et al., 1995) a una concentración final de 0,5 uM con 10 μL del 2X Master Mix Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green qRT-PCR (Stratagene), 0,8 μL de RT/RNAse block y 4,2 μL de agua libre de ARNasas en un volumen total de reacción de 20 μL. La reacción se desarrolló en base al siguiente perfil de temperaturas: 42°C por 30 min para la retrotranscripción, 95°C por 3 min para la inactivación de la retrotranscriptasa y activación de la polimerasa, 35 ciclos de 95°C por 30 s para desnaturalización, 58°C por 30 s para hibridación y 72°C por 100 s para la elongación, y la extensión final a 72°C por 10 min.

El producto amplificado fue utilizado como templado para realizar una segunda amplificación y así completar el proceso de PCR anidado. Este segundo PCR consistió en amplificar un fragmento de una longitud esperada de 523 pb. Para esto, se mezclaron 1,5 μL del templado con los partidores WB1 (5'-CCGC AACTTACTTGAGATCCATTATGC-3') (Williams et al., 1999) y AIR (5'-GTCTCGTCCTCWAGBCG GACGTATG-3') (Tapia et al., 2015) a una concentración final de 0,5 μM, 15 μL de 2X DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific) y 10,5 μL de agua libre de ARNasas en un volumen total de reacción de 30 μL. La reacción se desarrolló en base al siguiente perfil de temperaturas: 95°C por 5 min para la activación de la ADN polimerasa Taq, 35 ciclos de 95°C por 30 s para desnaturalización, 60°C por 30 s para hibridación y 72°C por 45 s para la elongación, y la extensión final a 72°C por 10 min.

El fragmento amplificado resultante del PCR anidado se separó mediante electroforesis en gel de agarosa a una concentración de 1,2%. Una vez diferenciadas las bandas, éstas se cortaron y se transfirieron a tubos de microcentrífuga, para luego ser purificadas usando el kit E.Z.N.A.™ Gel Extraction Kit (OMEGA biotek) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN obtenido de cada muestra fue eluído con 55 μL de agua grado biología molecular. Los productos purificados se secuenciaron por duplicado en Macrogen Inc., Corea, usando un analizador de ADN modelo ABI3730XL (Applied Biosystems).

Las secuencias obtenidas se compararon y clasificaron en base a cepas de referencia de birnavirus acuáticos chilenos y extranjeros disponibles en Genbank y reportadas en publicaciones científicas (i.e., Blake et al., 2001; Eissler et al., 2011; Mutoloki & Evensen, 2011; Calleja et al., 2012; Ruane et al., 2015; Jorquera et al., 2016). Además se incluyen algunas muestras utilizadas también en el trabajo realizado por Tapia et al. (2015) (ver Tabla 1). El análisis y edición de las secuencias se realizó con el programa MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013), por medio de un alineamiento múltiple de secuencias utilizando el algoritmo ClustalW(Thompson et al., 1994). Posteriormente, se construyó un árbol en base a la composición de los aminoácidos derivados de las secuencias con el método de Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) usando el modelo de sustitución distancia p. La validez estadística de los resultados obtenidos con el árbol, se evaluó mediante el método estadístico Bootstrap con 1.000 ciclos de iteraciones.

La técnica de PCR anidado utilizada permitió confirmar de manera rápida y eficiente la presencia de IPNV en las muestras analizadas, tomando el proceso completo no más de un día. Adicionalmente, con el producto obtenido de la segunda ronda de PCR se secuenció un fragmento de la proteína VP2 de 523 pb aproximadamente. Con este fragmento se construyó un árbol filogenético condensado (Fig. 1), donde se muestran solo los Genogrupos 1 y 5. Es importante recalcar que en este estudio, se trabajó directamente a partir de muestras de tejido infectado de peces y no con aislados virales; por lo que la técnica permite obtener material genético para realizar la secuenciación y posterior genotipificación de los virus sin tener que realizar el laborioso proceso de cultivo celular e infección, que puede tardar más de dos semanas. Esto fue confirmado en el trabajo de Tapia et al. (2015) donde algunas de las muestras analizadas aquí, fueron también aisladas en células CHSE-214 y posteriormente amplificadas de forma convencional para su secuenciación, obteniendo secuencias casi idénticas a las obtenidas mediante el PCR anidado. De esta forma, la técnica del PCR anidado permitió incluso amplificar muestras con material genético de virus que no pudieron ser aislados en cultivo celular (i.e., CUP, P1-10, ATS3, PITR2, IPNV03, AYCH, AYCHV, IHJS, MADA, DANN y ADMV). Otros autores han logrado resultados similares a los descritos en este trabajo, Cutrín et al. (2005) por ejemplo, comparó los métodos de aislamiento en cultivo celular, RT-PCR y PCR anidado, para la detección de IPNV en muestras de sangre de turbot (Scophthalmus maximus) asintomáticos. Los resultados mostraron, que ambas técnicas basadas en PCR fueron más sensibles que el aislamiento en cultivo celular; y además la técnica de PCR anidado logró detectar IPNV en un mayor número de peces muestreados en comparación con el RT-PCR.

 

Figura 1. Árbol filogenético condensado construido en base a las secuencias
de aminoácidos deducidas de VP2 mediante el método de Neighbor-Joining con
un bootstrap de 1000 iteraciones. El grado de cercanía entre las secuencias
se calculó mediante el método de distancia p. Los triángulos negros representan
a los virus secuenciados en este trabajo.

 

El análisis filogenético a nivel de aminoácidos (Fig. 1) muestra que los virus de este estudio se clasifican dentro de los dos genogrupos previamente reportados en el país, el Genogrupo 1 y 5 (Eissler et al., 2011; Mutoloki & Evensen, 2011; Calleja et al., 2012; Tapia et al., 2015; Jorquera et al., 2016). En la Figura 1 se observan dos subgrupos dentro del Genogrupo 5, el 5A que incluyó los virus reportados para Chile, en este y otros trabajos anteriores y el 5B que agrupó cepas de origen australiano. En el Genogrupo 1 se distinguen a su vez tres subgrupos, uno correspondiente a los genotipos 1-3 del análisis filogenético mostrado por Blake et al. (2001), otro solamente compuesto por el genotipo 4 y un último compuesto únicamente por los virus chilenos de este estudio y los reportados en trabajos previos. Este subgrupo también fue reportado por Tapia et al. (2015), por lo que sugerimos que este cluster sea considerado como un genotipo chileno dentro del Genogrupo 1. La única excepción a este subgrupo es la cepa VUV/84, que corresponde a la cepa original aislada en 1984 en Chile y mantenida en cultivo celular desde esa fecha. Esto podría estar asociado a que dentro de una población viral se espera que se genere un sinfín de variantes genéticas en su continua búsqueda de eficacia biológica, por lo que la población viral resultante se origina en respuesta adaptativa a esta dinámica (Domingo et al., 2000). Sin embargo, el genoma de la cepa VUV/84, no ha sido sometido a la misma presión selectiva ni ha competido con la actual población de virus chilenos en los procesos de mutación, por lo que no formaría parte de este cluster. Al analizar en conjunto los datos publicados de todos los virus IPN secuenciados en Chile durante los últimos años (Eissler et al., 2011; Mutoloki & Evensen, 2011; Calleja et al., 2012; Tapia et al., 2015; Jorquera et al., 2016), se observa que están distribuidos en todas las regiones del país donde hay producción masiva de salmónidos (i.e., Los Ríos, Los Lagos, Aysén y Magallanes), y que existe una predominancia de las cepas clasificadas en el Genogrupo 5 (78,8%) sobre el Genogrupo 1 (21,2%) (Tabla 2). Además, el virus infecta a todas las especies de salmónidos cultivadas en el país, con una mayor incidencia en S. salar, como también lo demuestran los informes sanitarios de SERNAPESCA, donde esta especie es la que muestra mayor porcentaje de mortalidad causada por IPN y el mayor número de diagnósticos de la enfermedad (SERNAPESCA, 2014a).

 

Tabla 2. Información IPNV chilenos secuenciados. ( ) Número de IPNV secuenciados, NR no
reportado. *Sin considerar virus incluidos en Tapia et al. (2015). **Sin considerar virus
incluidos en Tapia et al. (2015) y Jorquera et al. (2016).

 

En la Tabla 2 se observa que, para este trabajo, todos los IPNV chilenos del Genogrupo 1, fueron detectados en trucha arcoíris (O. mykiss) o salmón coho (O. kisutch), mientras que los virus del Genogrupo 5 se encontraron en salmón del Atlántico (S. salar), indicando una posible relación hospedador-específica de los genogrupos identificados. Esta relación, también se observó al realizar el análisis de todos los virus secuenciados y reportados en el país, donde el 100% de los virus clasificados dentro del Genogrupo 1 resultó ser del género Onchorhynchus y el 97,6% del Genogrupo 5 fue detectado en S. salar (Tabla 2). Sin embargo, esta asociación no es exclusiva, como se reporta en el trabajo realizado por Callejas et al. (2012), donde virus clasificados como Sp (Genogrupo 5) por la técnica de RT-PCR en tiempo real fueron detectados en muestras de truchas arcoíris. Asimismo, se han secuenciado aislados provenientes de alevín de trucha arcoíris (Tapia et al., 2015) y salmón coho (Jorquera et al., 2016), que resultaron clasificados dentro del Genogrupo 5. Para probar estadísticamente la asociación entre los genogrupos, a nivel de género y especie, se realizó el test de exactitud de Fisher utilizando el sitio web GraphPad QuickCalcs (http://www.graphpad.com/quickcalcs/contingency1/), resultando la relación en ambos casos como altamente significativa entre las variables (P < 0,001). Este tipo de relación hospedador-específica también ha sido reportada para otros virus de salmónidos, como el virus de la Necrosis Hematopoyética Infecciosa (IHNV) en Norteamérica, donde la mayoría de los aislados de los genogrupos denominados U y M, provienen predominantemente de salmón rojo (Oncorhynchus nerka) y trucha arcoíris, respectivamente (Garver et al., 2003). Estudios basados en desafíos experimentales con ambas especies y genogrupos han mostrado que esta relación está asociada a una virulencia específica para cada hospedador (i.e., mortalidad causada por la infección), la cual depende principalmente de la capacidad del virus de entrar en el pez hospedador y de replicarse rápidamente (Peñaranda et al., 2009, 2011; Purcell et al., 2009). De igual forma, la relación hospedador-específica encontrada en muestras de campo en este estudio podría ser confirmada mediante el desarrollo de un estudio de infección in vivo de ambos genogrupos del virus IPN en salmón del Atlántico y especies del género Oncorhynchus, para determinar si también está asociada al nivel de virulencia que estos genogrupos puedan presentar en cada especie. La confirmación de esta relación hospedador-específica mediante desafíos experimentales puede proveer información importante para el manejo y control del IPNV en Chile.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen especialmente a los inspectores de SERNAPESCA por su ayuda en la realización de los muestreos. Este estudio fue financiado por los siguientes proyectos: Proyecto SERNAPESCA R.E.N° 1090 "Estudio de evaluación y estandarización de métodos de diagnósticos para la determinación del Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa IPNv"; Proyecto DIUV-CID N°01/03; Proyecto SUBPESCA R.EX N°1548, código 2013-32-17 "Identificación de cepas y nuevas variantes del Virus IPN y evaluación del impacto de éstas en atención a su distribución geográfica y características de cuadros clínicos", Proyecto "Evaluación hidrográfica y epidemiológica del Fiordo Cupquelán, Región Aysén (Primera Etapa)", Salmones Cupquelán S.A. y Proyecto FIP N° 2014-60: "Determinación de factores epidemiológicos de riesgo en la presentación clínica de la enfermedad Necrosis Pancreática Infecciosa".

 

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Received: 29 February 2016; Accepted: 8 July 2016

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