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Revista chilena de cardiología

versión On-line ISSN 0718-8560

Rev Chil Cardiol v.28 n.1 Santiago abr. 2009

 

Revista Chilena de Cardiología - Vol. 28 N°1 81-89, 2009

INVESTIGACIÓN BÁSICA

La vía de señalización Rho A/ Rho Kinasa se encuentra activada en el miocardio en ratas con fibrosis cardíaca inducida por isoprotenerol

RHO A/ RHO kinase pathway is activated in the myocardium of rats with isoprotenerol - induced fibrosis

 

Mónica Vargas*, Paulina Rivera, María Paz Ocaranza, Jorge Jalil

Pontificia Universidad Católica de Chile, Departamento de Enfermedades Cardiovasculares, Laboratorio de Cardiología Molecular.

* Alumna de cuarto año de la carrera de Medicina.

Correspondencia:


Resumen

En pacientes con insuficiencia cardíaca la actividad adrenérgica está aumentada, lo que induce en el largo plazo, a cardiotoxicidad y mayor deterioro de la función ventricular. La administración experimental de Isoprotenerol, un agonista li-adrenérgico, produce hipertrofia ventricular, daño y fibrosis miocárdica. La via de señalización intracelular RhoA/Rho-Kinasa (ROCK) participa en el remodelamiento cardiovascular, no estando clara la relación entre la activación de esta vía y el desarrollo de fibrosis miocárdica.

Objetivo: Determinar si existe activación de la vía ROCK en ratas con fibrosis miocárdica inducida experimen-talmente por Isoprotenerol, mediante cuantificación de la fosforilación de la proteína blanco 1 de la fosfatasa de la miosina (MYPT1).

Métodos: Se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos (100 ± 10 gr.); 10 como grupo control con administración de suero fisiológico y 10 en el grupo experimental con inyección subcutánea de Isoprotenerol Hemisulfato, 5 mg/kilo de peso por día, por un período de 10 días. Se determinó la presión arterial sistólica (PAS), la masa relativa ventricular izquierda (MRVI), la activación de ROCK a través de niveles de MYPT1 por Western Blot y se cuantificó la fibrosis en Ventrículo Izquierdo por análisis moríométrico del colágeno (en tinciones con Rojo de Picrosirio).

Resultados (promedio ± ES, *=p<0,05): Los resultados en Presión Arterial Sistólica fueron 119,6 ±8,1 mmHg en el grupo control y 113,8 ± 5,2 mmHg en el grupo tratado con Isoprotenerol, la MRVI fue de 358,3 ±10,9 mg/g en las controles y 495,3 ± 42,02* mg/g en ratas Iso. La fracción volumétrica de colágeno (FVC) en miocardio y subendocardio fue 3 ±0,3 y 3,3 ± 0,4 en ratas control; en ratas Iso fue 5,2 ±0,7y 7,4 ± 1,3* respectivamente. Las FVC totales fueron 3,2 ±0,4 para controles y6,3± 1,6*para ratas Iso. La activación de la vía ROCK, medida como la relación MYPT1 fosforilada/total, en ratas control fue 2,5 ±0,8 y en ratas tratadas con Isoprotenerol fue 4,7 ± 2,2*.

Conclusión: La vía de señalización ROCK se encuentra activada en forma importante en el miocardio en ratas con hipertrofia y fibrosis cardíaca inducida por isoprotenerol. El rol causal de esta vía sobre los mecanismos de daño cardíaco evaluados, así como el efecto preventivo que pudieran tener los antagonistas de ROCK sobre la fibrosis y el daño cardíaco en este modelo experimental, deberían ser estudiados.


Background: Patients with heart failure have increased adrenergic activity, which in turn induces cardiotoxicity, and further damage to the myocardium. Isoprotenerol induces ventricular hypertrophy with myocardial fibrosis. RHO AJ RHO Kinase pathway (ROCK) participates in myocardial remodeling, but it is not known whether ROCK is involved in the fibrotic process.

Aim: To ascertain whether ROCK is activated in rats with Isoprotenerol -induced myocardial fibrosis, measuring ROCK by phosphorylation of the myosin phosphatase (MYPT1).

Methods: We used male Sprague-Dawley rats (100 ± 10 g); 10 rats were used as controls and received sq saline; 10 rats in the experimental group received sq Isoprotenerol (ISO rats) 5 mg/k body weight/day, during 10 days. We measured systolic blood pressure (SBP), left ventricular mass (LVM) and ROCK, which was measured by phophorylation of the MYPT1 protein using Western Blot. Myocardial fibrosis was measured by morphometry of collagen in Picrosirius red stained samples, and was expressed as collagen volume fraction (CVF). Results were expressed as average ± SEM; *=p<0,05.

Results: SBP was 119,6 ±8,1 mmHg in controls and 113,8 ± 5,2 mmHg in ISO rats; LVM was 358,3 ± 10,9 mg/g in controls and 495,3 ± 42,02* mg/g in ISO rats. CVF in the myocardium and subendocardium were 3 ± 0,3 and 3,3 ± 0,4 in control rats; values in ISO rats were 2 ± 0,7 y 7,4 ± 1,3* respectively. Total CVF were 3,2 ± 0,4 in controls and 6,3 ± 1,6* in ISO rats. ROCK, expressed as phosphorylated MYPT1 /total MYPT1 in control rats was 2,5 ±0,8 and 4,7 ± 2,2*in ISO rats.

Conclusion: ROCK pathway is significantly activated in the myocardium of ISO rats. ROCK antagonists for preventing myocardial fibrosis should be evaluated in this experimental model.

Key Words: Rho Kinase, Myocardium, Fibrosis, Isoproterenol.


 

Introducción

La alta prevalencia de hipertensión arterial (HTA) en todos los países, es un problema clínico-epidemiológico importante, debido al alto riesgo cardiovascular que implica. Uno de los principales factores involucrados en el aumento del riesgo cardiovascular, es el remodelado cardíaco patológico y el desarrollo de hipertrofia ventricular izquierda (HVI), que es la adaptación inicial a una sobrecarga mecánica del corazón con crecimiento de los cardiomiocitos1'2. En la hipertrofia ventricular patológica, se observan, además, cambios en la matriz extracelular del miocardio, con fibrosis miocárdica significativa que inicialmente aumentará la rigidez miocárdica y posteriormente puede asociarse a disminución de la función sistólica 3'45.

Por otro lado, la activación del Sistema Renina Angiotensina (SRA) y del sistema adrenérgico -que puede ocurrir en la HTA y que habitualmente se presenta en la insuficiencia cardíaca- inducen HVI y fibrosis miocárdica in vivo e in vitro6-9. La administración experimental de Isoprotenerol (ISO), un agonista li-adrenérgico, lleva a HVI, necrosis y apoptosis cardíaca, proliferación de fibroblastos, fibrosis miocárdica y desarrollo posterior de falla cardíaca10"13; y por esto es un modelo experimental muy utilizado de HVI y de fibrosis miocárdica.

La vía de señalización intracelular RhoA/Rho-kinasa (ROCK) es un mecanismo novedoso, con participación significativa en el remodelado cardiovascular y renal patológico, descubierto en la última década. Esta vía es activada por agonistas de receptores acoplados a la proteína G de membrana, como angiotensina II (Ang II), endotelina o noradrenalina y produce contracción de las células musculares lisas e HTA, activando fosfolipasa C, aumentando la proteinkinasa C y fosforilando la cadena reguladora de miosina ||14-16 caló 2007 La vía R0CK aumenta la sensibilidad al calcio en la contracción de la célula muscular lisa vascular y modula la fosforilación de la cadena liviana de la miosina al inhibir la fosfatasa de la miosina. La activación de ROCK produce, además, una cadena de eventos celulares como deregulación de la óxido nítrico sintasa, activación de NADPH oxi-dasa con aumento del estrés oxidativo, lo que lleva a aumento de TGFB, PKC y de MAPK-ERKV2 y activación de NFKfi con aumento de la expresión de PAI-114Cal°.

Estos mecanismos promueven remodelado cardiovascular patológico, además de otros procesos patológicos (aterogénesis, resistencia a insulina y vasoconstricción).

Al activarse ROCK, una de las proteínas que se fosforila es la fosfatasa de la proteína target 1 (MYPT1) de la cadena liviana de la miosina (con lo que se produce vasoconstricción)1420. Por esta razón la fosforilación de MYPT1 se utiliza como un marcador de la activación de ROCK.

Poco se conoce sobre la relación entre hipertrofia, fibrosis miocárdica y activación de ROCK, y no existe información sobre esta relación en el modelo de HVI y fibrosis miocárdica experimental inducidas por ISO. La hipótesis del trabajo fue que la HVI y fibrosis miocárdica experimental inducidas por ISO se asocian a activación miocárdica de ROCK.

Métodos

Diseño del estudio: Se utilizó un modelo experimental de fibrosis miocárdica inducida por Isoprotenerol (ISO) en ratas. Se usaron ratas Sprague-Dawley macho (peso 100 ±10 gr.) obtenidas del Vivero Institucional, en 2 grupos experimentales (grupo ISO y grupo control, 10 ratas por grupo). Los animales se mantuvieron en jaulas individuales en un cuarto controlado con ciclos de 12 h de luz y oscuridad, y con alimento standard para ratas y agua ad-libitum.

Inducción de fibrosis e hipertrofia miocárdica: Las ratas recibieron una inyección subcutánea de Isoprotenerol Hemisulfato, 5 mg/kilo de peso por día, por un período de 10 días, en el mismo horario. El grupo control de ratas recibió inyecciones con suero salino (suero fisiológico al 0,9%). Las ratas se pesaron antes de cada inyección, para el cálculo de la dosis y se fueron sacrificadas al día 1121.

Obtención de muestras de ventrículo izquierdo: Una vez sacrificada la rata, se extrajo el corazón, se separaron los ventrículos, se lavaron extensamente con solución salina para remover toda la sangre contaminada y se pesaron. Los ventrículos izquierdos se cortaron en 3 secciones transversales, tomando el anillo central para fijación en formalina, fijación en parafina, tinción con Rojo de Picrosirio y posterior análisis morfométrico. El ápex se conservó para Western Blot en nitrógeno líquido y se almacenó a -80° hasta su procesamiento y análisis.

Cuantificación de hipertrofia cardíaca: Se determinó el grado de hipertrofia cardíaca en cada animal midiendo masa relativa de ventrículo izquierdo (MRVI = peso VI (mg) *100/ peso corporal (gr)22.

Análisis morfométrico de colágeno miocárdico2122:

Las muestras en parafina (5 um de espesor) se tiñeron con Rojo de Picrosirio para su evaluación Histológica. Se capturaron en forma sistemática imágenes representativas de dichas muestras con una cámara digital, en la zona miocárdica y subendocárdica, teniendo un total de 40 fotos por VI. Luego se analizaron las fotos con un programa ad hoc previamente validado sobre una plataforma Matlab21'22, con el que se cuantificó el porcentaje de colágeno miocárdico (fracción volumétrica de colágeno, FVC) para las zonas subendocárdica y miocárdica media en cada muestra, lo que se promedió para cada animal con lo que se obtuvo la FVC total del miocardio.

Actividad miocárdica de ROCK evaluando el grado de fosforilación de la Fosfatasa de la Proteína Target 1 (MYPT1)17-19-23: La vía ROCK modula la fosforilación de MYPT1, por lo que MYPT1 fosforilado es utilizado como marcador de activación de ROCK. Los niveles de MYPT1 (fosforilado, F y total, T) en VI, se midieron por Western Blot. Se homogenizaron los VI en 500 ul de tampón de lisis por muestra y se centrifugaron a 10.000 RPM por 30 min. a 4°C. El contenido de proteínas se midió por el método de Bradford, se tomaron 100 ul del extracto proteico y se separaron por electroforesis en geles SDS-PAGE al 6% a 80V Dichas proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa a 300 mA durante 1,5 h.

MYPT1-F: La membrana se incubó en solución PBS 1x-Tween 20 al 0,05% (PBST) en leche descremada (LD) al 7% por 2 h con agitación constante a temperatura ambiente. Después de 3 lavados de 10 min. con PBST, se incubó la membrana con el anticuerpo anti-MYPT1 fosforilado (Thr 696) en una dilución de 1/2000 en PBST con LD al 5%, durante toda la noche a 4°C, en agitación continua. Se continuó con 3 lavados de 10 min. con PBST, y luego se incubó con el anticuerpo anti-lgG de conejo unido a peroxidasa en una dilución 1/10.000 en PBST con LD al 5%, por 2 h. en agitación. Después de 3 lavados, se incubó con sustrato de quimioluminiscencia23.

MYPT1-T: Se incubó la membrana por 30 minutos a 50 °C en solución de lavado. Luego se lavó 3 veces (10 min. con PBST 0,05%), y se bloqueó con 7 % LD en PBST por 30 minutos a 37 °C. La incubación del anticuerpo anti-MYPT1 total se realizó a una dilución 1/1000 en solución con 5% de LD en PBST, durante toda la noche a 4°C, en agitación continua. Se continuó con 3 lavados y luego se incubó con anticuerpo anti-lgG de ratón unido a peroxidasa en una dilución 1/10.000 en PBST por 2 h. a temperatura ambiente con agitación continua. Después de 3 lavados (10 min.), la membrana se incubó con el sustrato de quimioluminiscencia23.

La intensidad de cada banda se analizó por densitometría mediante un scanner Hewlett-Packard y el software Un-Scan-lt para análisis densitométrico 23.

Análisis Estadístico: Los datos se analizaron con el programa estadístico SPSS 10.0 y fueron expresados como promedio ± SEM y se compararon ambos grupos con prueba de t-de Student.

Resultados

1.   Presión Arterial sistólica (PAS) y masa cardíaca.

La PAS inicial (97 ± 12 vs 92 ± 10 mm Hg) y final (120 ± 8 vs 114 ± 5 mm Hg) fue similar en ambos grupos (Control e ISO respectivamente).

El peso cardíaco total fue significativamente mayor en el grupo ISO con respecto al grupo control (870 ± 70 vs 640 ± 40 mg, p < 0.05, respectivamente). Análogamente, la masa relativa del ventrículo izquierdo (MRVI) fue significativamente mayor en el grupo ISO con respecto del grupo control (495 ± 42 v/s 358 ± 11mg VI /100 gr peso, p<0.05, respectivamente).

2. Análisis morfométrico del colágeno miocárdico.

La cantidad de colágeno miocárdico se expresa como Fracción Volumétrica de Colágeno (FVC) miocárdico. En el grupo control la FVC fue 3 ± 0.3% en el miocardio medio, 3.3 ± 0.4 % en el subendocardio y 3.2 ± 0. 4% como promedio miocárdico total (miocardio + subendocardio).

En el grupo ISO se observó un aumento significativo (p < 0.05) de la FVC tanto en el subendocardio (120 %) como en el miocardio medio (74%), respecto del grupo control. Por lo anterior, la FVC miocárdica total (subendocárdico y endocárdico) fue 2 veces mayor en el grupo ISO con respecto de los animales no tratados (p < 0.05) (Figuras 1 a 4).








Discusión

El principal hallazgo del estudio fue que el desarrollo de fibrosis e hipertrofia cardíaca experimental inducida por Isoproterenol está asociado a un aumento significativo de la actividad cardíaca de Rho Kinasa, cuantificada como niveles de fosforilación de la proteína MYPT1, hallazgo no observado previamente.

Con los resultados observados, se puede afirmar que en las ratas tratadas con Isoprotenerol se desarrolló hipertrofia ventricular y fibrosis miocárdica, debidas a mecanismos cardíacos de compensación y reparación, que llevan a incremento del volumen de los cardiomiocitos (Hipertrofia), sumado a aumento de la síntesis de ADN y ARN, con mayor expresión de genes como TGF-b, FGF, IGF, entre otros2425.

Además se ha descrito que existen receptores U-adrenérgico en los fibroblastos cardíacos26, que al ser estimulados inducen a proliferación celular con liberación de proteínas de matriz extracelular (PME) y metaloproteinasas (MMPs), aumenta el colágeno fibrilar en la matriz extracelular, y se produce fibrosis miocárdica1027.

La cuantificación de colágeno miocárdico en este modelo como porcentaje de colágeno, en relación a la masa ventricular (fracción volumétrica de colágeno) indica que la magnitud de la fibrosis en este modelo experimental es importante. La mayor cantidad de colágeno observada en la zona subendocárdica, respecto de la zona propiamente tal miocárdica, se debe principalmente a que el Isoprotenerol provoca microinfartos a nivel subendocárdico, lo que lleva a la formación de mayor cantidad de tejido fibrótico en esa zona28, además de ser la zona más alejada de las ramas de las arterias coronarias, lo que la hace más susceptible a isquemia, necrosis y fibrosis10-13.

Los niveles elevados de MYPT1-F en el miocardio en las ratas tratadas con ISO, indican que existe activación de la vía ROCK en este modelo experimental de fibrosis miocárdica.

El presente hallazgo nos permite plantear a Rho Kinasa como un posible blanco terapéutico en condiciones asociadas a fibrosis y/o HVI -en este caso, inducidas por ISO- usando inhibidores específicos de su actividad. En este sentido, hemos observado que en ratas con niveles genéticamente elevados de enzima convertidora de angiotensina y también de angiotensina II, la administración del inhibidor específico de Rho Kinasa, Fasudil, redujo los niveles de stress oxidativo y de expresión de genes de remodelado vascular patológico en la pared aórtica de estos animales23.

Nuestros hallazgos son semejantes a lo observado en otros modelos experimentales de fibrosis, daño e HVI con inhibidores de ROCK. En ratones deficientes en apolipoproteína E tratados crónicamente con Ang II, la inhibición de ROCK con Fasudil disminuyó la hipertrofia cardíaca inducida por Ang II29, previno la fibrosis perivascular, redujo el aumento de ANP y la expresión de colágeno III, y mejoró la función cardíaca sin modificar la PA. En ratones con infarto miocárdico experimental, la inhibición crónica de ROCK con Fasudil, previno el remodelado cardíaco30, específicamente, la mayor expresión de citokinas inflamatorias (TGF-R2 y TGF-R3 y el factor inhibidor de la migración de macrófagos) en la zona no infartada del VI fue suprimida en el grupo tratado con Fasudil30. La actividad de ROCK aumentó significativamente en la zona no infartada y fue suprimida por Fasudil lo que indica que ROCK participa en forma importante en la patogenia del remodelado post IAM que produce upregulación de citokinas proinflamatorias y la importancia terapéutica de su inhibición en la prevención de IC post IAM y eventualmente en otros tipos de IC. En un modelo experimental de daño y fibrosis miocárdica Inducidos por vasopresina en ratas, la inhibición de ROCK con Fasudil redujo significativamente la depresión del segmento ST y la fibrosis miocárdica Inducida por vasopresina31. En un modelo de hipertrofia cardiovascular e HTA inducidas por Ang II en ratas, Fasudil previno este proceso. Ang II Indujo acumulación perivascular de macrófagos y activación de ROCK, lo que disminuyó significativamente con Fasudil. La expresión vascular de NADPH oxidasa y la producción endotelial de aniones superóxido aumentó marcadamente con Ang II y se Inhibió con Fasudil. Esto plantea que ROCK participa en forma importante en la hipertrofia cardiovascular Inducida por Ang II en ratas32.

Futuros estudios deberían aclarar los mecanismos asociados a la activación miocárdica de ROCK en este modelo experimental, si ésta es primaria o secundaria y el perfil temporal de activación. También deberá ser evaluado en este modelo el posible efecto preventivo de los inhibidores de ROCK sobre a fibrosis miocárdica y la HVI.

Si esto último se de-muestra, podría pensarse en la utilización a futuro en la inhibición de esta vía de señalización en conjunto con antihipertensivos, vasodilatadores y fármacos antihipertróficos de uso actual (como inhibidores de la enzima convertidor de angiotensina, antagonistas de angiotensina II u otros) para potenciar sus respectivos efectos, sobre todo en términos terapéuticos respecto de fibrosis miocárdica, de HVI y de remodelado cardíaco patológico.

En conclusión, la vía de señalización ROCK se encuentra activada en forma importante en el miocardio en ratas con hipertrofia y fibrosis cardíaca inducida por isoprotenerol. El rol causal de esta vía sobre los mecanismos de daño cardíaco evaluados, como el efecto preventivo que pudieran tener los antagonistas de ROCK sobre la fibrosis y el daño cardíaco, deberían ser más profundamente evaluados en este modelo experimental.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado parcialmente por Fondecyt 1085208.

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Recibido el 26 de diciembre de 2008. Aceptado el 12 de enero de 2009

Dr. Jorge Jalil
PUC, Depto de Enfermedades Cardiovasculares,
Lira 85 Piso 2, Santiago
Fax: 6338574
Correo Electrónico: jjalil@med.puc.cl

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