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Revista chilena de cardiología

On-line version ISSN 0718-8560

Rev Chil Cardiol vol.30 no.1 Santiago  2011

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-85602011000100005 

Rev Chil Cardiol 2011; 30: 34 - 41

INVESTIGACIÓN CLÍNICA

 

Mayor actividad de rho kinasa en leucocitos circulantes se asocia a estrés oxidativo y rigidez arterial en hipertensos diabéticos

Increased Rho-kinase activity in peripheral leukocytes is associated to oxidative stress and decreased compliance of the arterial wall in diabetic hypertensive patients

 

Luigi Gabrielli, Alejandro Berkovitz, Italo Mora, Ulises Novoa, Iván Godoy, Paul MacNab, Samuel Córdova, Ivonne Padilla, Paola Rigotti, Lorena García, Sergio Lavandero, María Paz Ocaranza, Jorge Jalil.

División de Enfermedades Cardiovasculares. Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile.

Dirección para correspondencia


Resumen:

Introducción: La vía intracellular de RhoA/Rho kinasa es activada por agonistas de receptores acoplados a proteínas G pequeñas unidas a membrana. Su activación está relacionada al remodelado cardiovascular patológico. Previamente hemos observado aumento de actividad de Rho kinasa (ROCK) en pacientes con hipertensión arterial (HT) e hipertrofia ventricular izquierda como daño de órgano blanco. Pero su activación en relación a la diabetes no ha sido explorada en estos pacientes.

Objetivo: Evaluar activación de Rho kinasa y parámetros de estrés oxidativo en pacientes hipertensos con diabetes tipo II (DMII).

Métodos: Estudio comparativo entre pacientes con HT sin tratamiento, HT con DMII y hemoglobina glicosi-lada Alc > 7,5% y un grupo control normotenso. Se realizó ecocardiograma de superficie. Se midió activación de ROCK en leucocitos circulantes midiendo MYPT1 fosforilado/total (p/t) por Western blot y la velocidad de pulso carotídeo-femoral (PWV) para estimar distensibilidad arterial. El stress oxidativo se estimó midiendo ma-londialdehído (MDA) y 8-isoprostano (8-ISO) en suero.

Resultados: Se incluyeron 21 pacientes hipertensos con DMII, 38 pacientes hipertensos sin DMII y 34 controles normotensos. La edad promedio fue 51 ± 0,9; 48 ± 0,9 y 52 (p: NS) ± 1,1 y el 47%, 50% y 52% (p: NS) eran mujeres respectivamente. Los pacientes HT con DMII presentaron MYPTl p/t (5,6 ± 1,3; 3,6 ± 0,4; 2,1 ± 0,1 p< 0,01), MDA (1,8 ± 0,4/<M; 0,49 ± 0,08; 0,4± 0,06 p < 0,01), 8-ISO (C) y PWV (14 ± 0,9 m/seg; 11 ± 0,4; 8,1 ± 0,1) elevados versus los otros grupos.

Conclusiones: Los pacientes hipertensos con DM II presentan actividad de ROCK elevada respecto a hi-pertensos sin DM II a igual IMVI, además presentan parámetros de estrés oxidativo aumentados respecto a HT sin DM II y controles normotensos. Estos hallazgos están relacionados con una distensibilidad arterial alterada y podrían explicar en parte el mayor remodelado vascular patológico que presentan los pacientes HT con DM II.


Background: Rho/Rho-kinase intracellular pathway is activated by membrane bound small G-proteins. Activation of Rho/Rho-kinase pathway is related to pathologic cardiac remodeling. We have previously observed this activation (ROCK) in hypertensive patients with left ventricular hypertrophy. The influence of diabetes in this relationship has not been explored.

Aim: to evaluate the activation of Rho-kinase and oxi-dative stress in hypertensive patients with type II diabetes (DMII).

Methods: A comparative study between patients with untreated hypertension (HT), hypertensive patients with diabetes and hemoglobin A1c > 7.5% and normotensi-ve control subjects was performed. LVH was assessed by echocardiography. ROCK activity was measured in peripheral leukocytes by Western blot determination of phosphorilated / total MYPT1 ratio. Arterial compliance was determined by the relationship of carotid and femoral velocity signals (PWV) Oxidative stress was estimated by serum levels of malondialdehyde (MDA) and 8-isoprostane (8-ISO).

Results: Hypertensives with DMII (n=21) had a mean age of 51 ± 0.9 years, and 47% were females. Corresponding figures for 38 hypertensive patients without DM and 34 control patients were 48 ± 0,9 and 52 ± 1,1 (NS) and 50% and 52% females, respectively (NS). The MYPT1 p/t ratio was 5,6 ± 1,3; 3,6 ± 0,4; 2,1 ± 0,1 (p<0.01) in the 3 groups, respectively. MDA for the 3 groups was 1,8 ± 0,4/<M; 0,49 ± 0,08; 0,4± 0,06 (p < 0,01). The 8-isopros-tane levels were increased in diabetic hypertensives vs. the other groups. A similar difference was observed in PWV among groups (14 ± 0,9 m/sec; 11 ± 0,4; 8,1 ± 0,1).

Conclusion: At comparable levels of left ventricular mass index, diabetic hypertensive patients had increased ROCK activity compared to non diabetic hypertensives. Also, compared to non-diabetic hypertensives and normotensive controls, diabetic hypertensive patients exhibited increased levels of oxidative stress. These findings correlated with a decreased arterial distensibility and may help explain the adverse vascular remodeling observed in hypertensive patients with DMII.


 

Introducción

La guanosina trifosfatasa pequeña Rho y su blanco Rho-kinasa (ROCK) desempeñan un importante papel en la regularización de la presión arterial y en la contracción de la musculatura lisa vascular Rho es activada por diversos agonistas de receptores acoplados a proteínas G pequeñas unidas a membrana como angiotensina II, noradrenalina, endotelina y factores de crecimiento1. De esta manera, Rho se trasloca hacia la membrana plasmática donde activa ROCK. Al activarse ROCK por Rho, se fosforila la fosfatasa de la cadena liviana de la miosina, con lo cual esta fosfatasa es inhibida, favoreciéndose la contracción muscular lisa vascular, la formación de fibras de estrés y la migración celular1-3. Así, mediante estos mecanismos, la vía Rho/Rho-kinasa está ligada en forma significativa a numerosas patologías cardiovasculares tales como: hipertensión arterial e hipertrofia ventricular 4, ateroesclerosis y enfermedad coronaria 5, insuficiencia cardíaca6, estrés oxidativo7 y remodelado vascular patológico8.

Por otro lado, la diabetes mellitus tipo II (DMII) se asocia a múltiples condiciones patológicas como las anteriormente mencionadas, todas condiciones en las cuales la vía RhoA/Rho kinasa juega un rol importante 9. Existe evidencia experimental que muestra que el daño endotelial y el aumento de la permeabilidad vascular propias de la vasculopatía diabética 10, están ligadas a un aumento de la actividad de ROCK y a estrés oxidativo dado por un desbalance en los niveles de peroxinitritos y óxido nítrico 11. Productos de glicosilación avanzada forman complejos con RhoA aumentando la actividad de ROCK produciendo reorganización en el citoesqueleto de actina llevando a hipermeabilidad vascular y daño endotelial 12.

Además se ha visto en distintos modelos experimentales que el aumento de la actividad de ROCK se asocia al desarrollo y progresión de complicaciones microvasculares asociadas a la DM II y que su inhibición disminuye la progresión de estas alteraciones 13. Modelos de ratas diabéticas muestran aumento de la actividad de ROCK en la corteza renal y que la proliferación y fibrosis del mesangio depende, en parte, de la activación de la vía RhoA/Rho kinasa 14. Por último, en modelos de ratas diabéticas, el antagonismo de la vía RhoA/Rho kinasa con Fasudil mostró disminución de la proteinuria y de las alteraciones estructurales del glomérulo asociadas a la nefropatía diabética 15.

Sin embargo, considerando toda esta evidencia experimental, la activación de la vía RhoA/Rho kinasa en pacientes hipertensos con DMII no ha sido explorada. Por tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar la activación de la vía RhoA/Rho kinasa, niveles de estrés oxidativo y distensibilidad arterial en pacientes hipertensos esenciales (HT) con DMII.

Métodos

Estudio transversal en el cual se incluyeron tres grupos, uno formado por pacientes HT recientemente diagnosticados sin terapia, un grupo de HT con DMII cuya hemoglobina glicosilada A1C al momento del ingreso al estudio fuera > 7,5% con tratamiento hipotensor e hipoglicemiante y un grupo control normotenso sin DMII pareado por edad y sexo. Los criterios de exclusión fueron: edad < 18 años, insuficiencia renal (creatinina > 1,5 mg/dL), enfermedad hepática (transaminasa oxaloacética > 1,5 veces el valor normal alto), neoplasia en los últimos 4 años, infección activa (PCR > 1 mg/dL), usuarios de insulina, usuario de estatinas, historia de insuficiencia cardíaca o disfunción ventricular (fracción de eyección < 50%), antecedente de enfermedad coronaria y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.

Todos los sujetos del estudio firmaron un consentimiento informado aprobado por un comité de ética local.

Se registraron la características demográficas y parámetros de laboratorio clínico en todos los sujetos. Se midieron hemoglobina glicosilada A1C, glicemia, creatinina plasmática, niveles de colesterol total y LDL, ácido úrico y transaminasa oxaloacética.

Medición de la presión arterial

En todos los sujetos se evaluó la presión arterial sistólica y diastólica (en posición sentado) utilizando un esfingoma-nómetro de mercurio estándar. La fase I y V de los sonidos de Korotkoff se utilizaron para este fin. Se realizaron 3 determinaciones en dos días separados, a intervalos de 1 minuto y luego de 5 minutos de reposo. El diagnóstico de HT se consideró con valores > 140/90 de presión sistólica o diastólica respectivamente. Se consideró normotensión cuando ambos valores estuvieron bajo los mencionados anteriormente.

Estudio ecocardiográflco y evaluación no invasiva de la rigidez arterial.

En todos los sujetos se realizó un ecocardiograma de superficie en decúbito lateral izquierdo obteniéndose las visiones paraesternales y apicales habituales. Se utilizó un equipo Phillips IE-33 con un transductor S5-1 de 2,5-5 MHz por un operador experto y ciego. Se evaluó la función y masa ventricular izquierda, el tamaño auricular izquierdo (AI) y parámetros de función distólica. Todas las mediciones se hicieron según las recomendaciones de la American Society of Echocardiography16, 17 . Para el cálculo de la masa ventricular izquierda se utilizó la fórmula de Devereux18,19 y los valores fueron indexados. Como método de evaluación de la función sistólica se utilizó el cálculo de la fracción de eyección ventricular izquierda (FEVI) por el método de Simpson. Además, se determinó la velocidad de pulso carótido-femoral (PWV) como índice indirecto y no invasivo de la rigidez arterial. Para este fin se utilizó un equipo Complior 1 20.

Parámetros de estrés oxidativo

En todos los sujetos se midieron los niveles plasmáticos de malondialdehído (MDA) y de 8-Isoprostano (8-iso) como parámetros de evaluación del estrés oxidativo. Se obtuvieron 10 mL de sangre venosa periférica. La muestra fue centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos a una temperatura de 4 °C. El plasma fue separado y almacenado a -20 °C. Los niveles de MDA fueron determinados por el contenido de substancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS)21 y sus niveles se expresaron como /<M. Los niveles de 8-ISO fueron evaluados mediante un kit de in-munoensayo enzimático disponible comercialmente (Cayman Chem Co., Ann Arbor, MI) y sus niveles se expresaron como pg/mL21.

Medición de actividad de Rho-kinasa

La actividad de ROCK se evaluó midiendo la relación entre la fosfatasa de la cadena liviana de la miosina 1 fosfori-lada versus la total (MYPT1-p/t) en leucocitos circulantes, un objetivo directo de la vía de ROCK. Diez mililitros de sangre venosa con EDTA fueron vertidos sobre 10 mililitros de Histopaque (Histopaque-1077, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) y luego centrifugados. Los leucocitos fueron resuspendidos en PBS y centrifugados a temperatura ambiente dos veces. Se determinó la viabilidad celular mediante el test de exclusión de azul de tripan (usualmente 4 a 80 X 10 6 células viables con una viabilidad mayor del 95%) y luego se resuspendieron en un buffer de lisis. Las muestras fueron centrifugadas y el contenido proteico del sobrenadante fue determinado usando el ensayo de Bradford empleando BSA como estándar. La fracción soluble fue calentada a 95°C con muestra buffer SDS-PAGE para MYPT-1 para el análisis por Western blot 22.


Tabla 1. Características clínicas y de laboratorio basal.


Control

HT sin DM

HT con DM

ANOVA

(n = 34)

(n = 38)

(n = 21)

(p)


Edad (años)

52 ± 1,1

48 ±0,9

51 ± 0,9

NS

Mujeres (%)

52

50

47

NS

IMC (Kg/m2)

25,1 ± 0,6

25,4 ± 0,6

26,5 ± 0,6

NS

PAM (mmHg)

87 ± 1,2

121 ± 1,3 ¥

111 ± 1,9 *

< 0,01

Creatinina (mg/dL)

0,7 ± 0,02

0,8 ± 0,02

0,8 ± 0,03

NS

Glicemia (mg/dL)

91 ± 3

96 ± 3

150 ± 12 *

< 0,01

SGOT (U/L)

24 ± 1,6

23 ± 1,1

24 ± 2,2

NS

Ácido úrico (mg/dL)

4,5 ± 0,2

5,3 ± 0,3

4,9 ± 0,3

NS

Colesterol total (mg/dL)

191 ± 5

217 ± 7

203 ± 7

NS

Colesterol LDL (mg/dL)

113 ± 5

137 ± 6

118 ± 6

NS

*p < 0,05 versus controles e HT sin DMII post ANOVA.
¥p< 0,05 versus controles e HT con DMII post ANOVA
Abreviaciones: IMC: índice de masa corporal, PAM: presión
arterial media, SGOT: transaminasa oxaloacética.


Tabla 2. Estudio ecocardiográfico

Control

HT sin DM

HT con

ANOVA

(n = 34)

(n = 38)

DM (n = 21)

(p)

 
IMVI (gr/m2)

88 ± 3

108 ± 5 X

108 ± 6 X

< 0,01

Área AI4C (cm2)

17 ± 1

19 ± 2

20 ± 2

NS

Área AI2C (cm2)

17 ± 0,5

19 ± 0,7

18 ± 0,9

NS

Onda A

64 ± 3

74 ± 5

90 ± 6 *

0,01

Onda E

78 ± 3

70 ± 2

72 ± 3

NS

TD (mseg)

182 ± 5

193 ± 6

201 ± 7X

0,03

FEVI (%)

61 ± 4

63 ± 4

59 ± 3

NS


X p < 0,05 versus controles post ANOVA.

*P < 0,05 versus controles e HT sin DMII post ANOVA.


Abreviaciones: IMVI: índice de masa ventricular izquierda, AI: aurícula izquierda, TD: tiempo de desaceleración, FEVI: fracción de eyección ventricular izquierda.


Análisis estadístico

Para el cálculo del tamaño muestral se utilizó el programa Power and Sample size calculations versión 2.1.31 . Para una diferencia esperada de 20%, una potencia de 90%, error alfa de 5% los grupos debían ser al menos de 15 sujetos. Las variables discretas de expresaron como porcentajes y las continuas como promedios ± error estándar (EE). Para evaluar las diferencias entre los grupos se utilizó ANOVA de una cola y test post hoc de Bonferroni. Para evaluar correlaciones se utilizó el método de Pearson.

Resultados

Se incluyeron 21 pacientes HT con DMII con tratamiento hipotensor e hipoglicemiante, 38 pacientes HT sin DMII sin terapia y 34 controles normotensos. La edad promedio fue 51 ± 0,9; 48 ± 0,9 y 52 ± 1,1 (p: NS) y el 47%, 50% y 52% (p: NS) eran mujeres respectivamente. La terapia en los pacientes diabéticos era: inhibidores de la enzima con-vertidora 42%, antagonistas del receptor de angiotensina II 58%, metformina 85%, sulfonylureas 47%; los pacientes HT sin DMII y el grupo control se encontraban sin terapia al momento de la incorporación al estudio. No presentaron diferencias en otras características clínicas y de laboratorio, excepto en la glicemia que fue significativamente mayor en el grupo de HT con DM II (Tabla 1). La hemoglobina glicosilada A1C en el grupo de HT con DMII fue de 9,7 ± 0,8%.

Estudio ecocardiográflco y de rigidez arterial

No se observaron diferencias en la FEVI ni en el Área AI entre los tres grupos (Tabla 2). Los pacientes HT con y sin DMII presentaron índice de masa ventricular izquierda (IMVI) elevados respecto al grupo control, sin diferencias entre ambos grupos de hipertensos (Tabla 2). El resto de las características del estudio de función diastólica se muestran en la Tabla 2.

Los pacientes HT con DMII presentaron un PWV mayor respecto de los hipertensos sin DMII y controles. Los HT sin DMII presentaron PWV mayor respecto de los controles. (Figura 1).


Figura 1:
Velocidad de onda de pulso carotídeo-femoral en grupos control,
HT sin DMII e HT con DMII

 

Estudio de estrés oxidativo

Los pacientes HT con DMII presentaron niveles elevados de MDA y de 8-ISO respecto de los HT sin DMII y controles. Los pacientes HT sin DMII y controles presentaron niveles similares de ambos marcadores de estrés oxidativo. (Figuras 2 y 3).

Actividad de Rho kinasa.

Los pacientes HT con DMII presentaron actividad de ROCK significativamente elevada respecto a HT sin DMII y controles. Entre los pacientes HT sin DMII y el grupo control la diferencia observada no alcanzó significancia estadística (p = 0.09) (Figura 4).

No se encontraron correlaciones significativas entre los niveles de ROCK, estudio de rigidez arterial y parámetros de estrés oxidativo evaluados en los pacientes HT como grupo total y en los con y sin DMII en forma aislada.

Discusión

Los principales hallazgos del presente estudio son que los pacientes HT con DM II presentan actividad de ROCK elevada respecto a hipertensos sin DM II a igual IMVI, además, presentan parámetros de estrés oxidativo aumentados respecto a HT sin DM II y controles normotensos. Estos hallazgos están relacionados con una distensibilidad arterial alterada y podrían explicar en parte, las alteraciones vasculares de los pacientes HT con DM II. Desde el punto de vista clínico sólo existía evidencia de aumento de actividad de ROCK en leucocitos circulantes de pacientes con síndrome metabólico 22, sin haberse descrito estos hallazgos en la población de este estudio.

En modelos experimentales se ha demostrado que un aumento de la actividad de ROCK, por estimulación del receptor p del factor de crecimiento derivado de plaquetas, está ligada a migración y proliferación de células musculares lisas una característica principal del daño macroangio-pático por diabetes 23. La vía RhoA/Rho kinasa está involucrada en el aumento de actividad del factor de crecimiento tumoral p que produce aumento de matriz extracelular y fibrosis en glomérulos de ratas diabéticas 24 y que el daño de asociado a la nefropatía diabética es revertido por Fasudil, un antagonista de la vía RhoA/Rho kinasa 25 Además se ha visto que MYPT1 fosforilado se encuentra aumentado en la retina de ratas diabética luego de 2 semanas del inicio de la diabetes 26 y que la terapia con estatinas disminuye la actividad de ROCK y esto se asocia a disminución del daño cicatricial del vítreo y retina de ratas con retinopatía diabética 27. Toda esta evidencia está en concordancia con el hallazgo clínico de nuestro estudio, de un claro aumento de la actividad de ROCK en pacientes HT con DMII independiente del IMVI y que probablemente está involucrada en las complicaciones micro y macro angiopáticas de la misma.

En los pacientes HT con DMII se observa una rigidez arterial aumentada, hecho clínico antes descrito 28,29, lo cual en nuestros pacientes está asociado a una actividad de ROCK elevada. Sin embargo, no encontramos una correlación significativa entre estos hallazgos probablemente porque en el daño vascular del paciente diabético están involucrados muchos otros factores y uno en particular no es capaz de explicar el fenómeno.

Otro de los factores involucrados en el daño vascular del paciente HT con DMII es el estrés oxidativo. En pacientes diabéticos, la hiperglicemia produce un aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno a través de un incremento de la actividad de NADPH oxidasa 30, esto está ligado a disfunción endotelial, menor disponibilidad de óxido nítrico 31 y es considerado clave en la génesis de la nefropatía diabética 32. Por otro lado, se ha mostrado en modelos de isquemia reperfusión que un aumento en la actividad de la vía RhoA/Rho kinasa está ligada a mayor producción de especies reactivas de oxígeno vía NADPH oxidasa 1 y a disfunción endotelial 33. En nuestro estudio observamos un aumento en los marcadores de estrés oxi-dativo, MDA y 8-ISO, en los pacientes HT con DMII, este aumento podría estar dado en parte, por el aumento de la actividad de la vía RhoA/Rho kinasa demostrada en estos pacientes. No encontramos correlación significativa entre los marcadores de estrés oxidativo empleados y los niveles de actividad de ROCK, esto último se explica por la gran cantidad de sistemas involucrados en la generación de especies reactivas de oxígeno y que contribuyen a las alteraciones vasculares en estos pacientes 34 La diferencia encontrada en la actividad de ROCK entre hipertensos diabéticos y no diabéticos en nuestro estudio podría estar incluso subestimada, ya que los pacientes diabéticos se encontraban en su totalidad con antagonistas del sistema renina-angiotensina-aldosterona cuya actividad está ligada al sistema RhoA/Rho kinasa 35 y su antagonismo está asociado a una disminución de la actividad de ROCK y del remodelado vascular patológico 36. Respecto a esto último, queda abierta la pregunta clínica sobre el comportamiento de la actividad del sistema RhoA/ Rho kinasa en pacientes hipertensos diabéticos luego de un control óptimo de sus cifras tensionales y parámetros metabólicos.

Por tanto concluimos que pacientes HT con DMII presentan actividad de ROCK elevada. Esta vía está involucrada en múltiples mecanismos fisiopatológicos como estrés oxidativo, vasoconstricción y proliferación celular que pueden explicar, en parte, el daño micro y macro vascular, y podría constituir un objetivo terapéutico importante en estos pacientes.

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Recibido el 25 de enero de 2011 /Aceptado 13 de febrero de 2011

Correspondencia:

Jorge Jalil Milad
Jefe División de Enfermedades Cardiovasculares
Universidad Católica
jjalil@med.puc.cl

Luigi Gabrielli
Instructor Asociado División de Enfermedades
Cardiovasculares UC
lgabriel@uc.cl

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