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Revista chilena de cardiología

versión On-line ISSN 0718-8560

Rev Chil Cardiol vol.37 no.3 Santiago dic. 2018

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-85602018000300194 

Investigación básica

En el modelo preclínico de insuficiencia cardíaca por disfunción sistólica en ratón (coartación de aorta torácica) la velocidad de flujo carotídeo determinada precozmente se asocia a función ventricular izquierda tardía

Carotid flow velocity is associated to late ventricular function in mice with preclinic systolic dysfunction induced by thoracic aortic coarctation

José F Vargas 1  

Luigi Gabrielli 2  

Cristián Mancilla 2  

Rodrigo Fernández 2  

Gabriel Olivares 3  

Cristián Molina 2  

Jackeline Moya 2  

Hugo Verdejo 2  

María Paz Ocaranza 2  

Jorge E Jalil 2   * 

1 Pontificia Universidad Católica de Chile, Escuela de Medicina Departamento de Cirugía Vascular y Laboratorio de Cardiología Molecular, Santiago, Chile.

2 Pontificia Universidad Católica de Chile, Escuela de Medicina, División de Enfermedades Cardiovasculares y Laboratorio de Cardiología Molecular, Santiago, Chile.

3 Clínica Universidad de los Andes, Cirugía Cardíaca, Santiago, Chile.

Resumen:

Los modelos experimentales de falla cardíaca con fracción de eyección disminuida en murinos son pocos. Uno de estos modelos es el de coartación de la aorta torácica en el arco aórtico (COA) en ratones. Un aspecto importante en su desarrollo es la evaluación precoz del procedimiento y su relación con la función sistólica posterior. En este sentido, las velocidades de flujo carotídeo y la relación entre ambos flujos (derecho, pre-coartación; izquierdo post coartación) pueden permitir evaluar tempranamente la precisión del procedimiento y relacionarse más tardíamente con la función sistólica VI.

Nuestro objetivo fue comparar precozmente (semana 2 post operatoria) las velocidades de flujo en ambas carótidas (Doppler continuo) y tardíamente (semana 5 postoperatoria) la función sistólica VI (Ecocardiograma de superficie) en ratones seudocoartados o sham (n= 6) vs ratones COA (n = 12).

Se confirmó una diferencia estadísticamente significativa en la relación de velocidades de flujo entre ambas carótidas medida precozmente entre los ratones sham y COA (1,1 ± 0,1 vs 2,5 ± 0,5, p< 0,001), lo que se correlacionó con un deterioro significativo de la función sistólica del ventrículo izquierdo evaluada a las 5 semanas en los ratones COA.

Conclusión:

En este modelo preclínico de falla cardíaca por sobrecarga de presión con fracción de eyección VI disminuida en ratón, el aumento precoz de la velocidad de flujo en la arteria carótida derecha (pre-coartación en el modelo COA) y sobre todo de la relación entre las velocidades de flujo carotídeo entre ambas carótidas se asocia a deterioro importante de la función sistólica VI cinco semanas después de efectuada la COA, lo que permite predecir la efectividad del procedimiento en este modelo experimental.

Abstract:

There are few experimental models of heart failure with reduced ejection fraction in murines. One of these models is transverse aortic coarctation (TAC) in mice. However, an important challenge in its development is the early evaluation of the procedure and its relationship with late systolic LV function. In this sense, carotid flow velocities and the relationship between both (right, precoarctation, left post-coarctation) may allow early evaluation of the accuracy of the procedure and be related to late LV systolic function.

The aim was to compare early (week 2 post-operative) flow velocities determined in both carotid arteries (by continuous Doppler) with late (week 5 postoperative) LV systolic function (by echocardiogram) in sham (n= 6) vs. TAC (n: 12) mice.

We confirmed a statistically significant difference in the early ratio of carotid flow velocities (left/right common carotid velocity ratio) between sham and TAC mice (1.1 ± 0.1 vs 2.5 ± 0.5, p< 0.001) and this correlated well with a deteriorated left ventricular function in the TAC mice after 5 weeks.

In this preclinical model of cardiac failure due to pressure overload with reduced LV ejection fraction in the mouse, the early increase in right carotid flow velocity (precoarctation) and especially the relationship between precoarctation/postcoarctation carotid flow velocities is associated with significant impairment of LV systolic function five weeks after the TAC, which allows to predict the effectiveness of the procedure in this experimental model.

Introducción

Los modelos experimentales de falla cardíaca con fracción de eyección disminuida en murinos son pocos. Uno de estos modelos es el de coartación de la aorta torácica en el arco aórtico (COA) en ratones. Fue descrito por Rockman en el año 1991 y es frecuentemente utilizado para evaluar hipertrofia ventricular e insuficiencia cardíaca inducida por sobrecarga de presión del ventrículo izquierdo1), (2), (3.

Un desafío muy importante en desarrollo de los modelos experimentales de falla cardíaca es la evaluación precoz del procedimiento y su relación con la función sistólica tardía. En este sentido, la pregunta recurrente es como evaluar precozmente la efectividad de este modelo experimental.

En el modelo COA en ratón la ligadura aórtica transversa se realiza entre el tronco braquiocefálico y el origen de la arteria carótida común izquierda y la obstrucción al flujo creada genera una aceleración compensatoria del flujo a nivel de la carótida común derecha y un enlentecimiento del flujo a nivel de la carótida común izquierda. En consecuencia, las velocidades de flujo carotídeo de las 2 carótidas y la relación entre ellas (derecha: pre-coartación; izquierda: post coartación) podrían permitir evaluar tempranamente la precisión del procedimiento y relacionarse más tardíamente con el deterioro de la función sistólica VI, lo que no se ha evaluado en nuestro medio.

El objetivo del presente estudio fue comparar precozmente (semana 2 post operatoria) las velocidades de flujo de ambas carótidas (Doppler continuo) y tardíamente (semana 5 postoperatoria) la función sistólica VI (Eco-cardiograma de superficie) en ratones sham vs ratones cometidos a COA.

Métodos

Este fue un estudio experimental, prospectivo y randomizado en ratones C57BL6 macho (23-24 g). Se estudió un total de 18 ratones. Todos los procedimientos experimentales realizados fueron previamente aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal, y se siguieron los principios de cuidado animal establecidos por el comité de bienestar animal institucional (ID protocolo: 150807011). En el estudio piloto previo observamos que al ajustar la coartación con una aguja 27G en ratones con peso entre 22 y 24 gm, una disminución del área de la aorta equivalente al 90% de su diámetro original. En ese estudio piloto se realizó coartación aórtica con agujas de 25, 26, 27 y 28 G en ratones con pesos entre 22 y 30 g y el % de reducción de diámetro aórtico fue medido in vivo con ecocardiografía.

Todos los animales fueron anestesiados con isofluorano en cámara acondicionada, fueron depilados en la región pre esternal, e intubados con cánula 22G. Luego fueron ventilados en posición supina usando un ventilador para animales pequeños modelo SAR-830/AP®. Se comprobó adecuada ventilación y sedación durante todo el proceso utilizando monitoreo continuo de la frecuencia cardíaca y saturación de oxígeno transcutáneas con el sistema Physiosuite®. Los ratones se depilaron en la región pre esternal con crema depilatoria VEET® aplicada durante 1 minuto y luego se lavó prolijamente la zona operatoria usando jabón con clorhexidina y alcohol (3 veces cada uno).

6 ratones fueron randomizados a ser sometidos a cirugía sham que consistió en apertura esternal y disección de mediastino liberando el timo para exponer el arco aórtico, rodearlo con sutura de seda 7-0, retirar la seda y finalmente cierre con punto al plano esternal y piel. Luego se cubrió la herida operatoria con mezcla de ungüento dérmico de bacitracina (500UI/g) y neomicina (5 mg/g) junto con solución tópica de lidocaína al 4%.

Los ratones randomizados a cirugía de coartación (n = 26) recibieron la misma preparación. Una vez expuesto el arco aórtico, éste se rodeó con sutura de seda 7-0 entre el tronco braquiocefálico y la carótida izquierda. La sutura se anudó sobre aguja de 27G que fue usada para calibrar de manera estándar el diámetro de la coartación. Los diferentes planos se cerraron de la misma forma que en el grupo Sham.

Los ratones fueron despertados y extubados cuando ya lograban ventilación espontánea. Luego se dejaron en cámara de oxígeno durante las primeras horas de recuperación. En el postoperatorio precoz se administró tramadol oral en dosis de 30 mg/kg diluido en agua destilada. La analgesia postoperatoria continuó con tramadol oral. Se administró miel y pellets de alimento para lograr mantener un peso adecuado. Además, se administró suero glucosado 20% subcutáneo el primer y segundo día postoperatorio en dosis de 1 ml cada vez.

Evaluación precoz de la velocidad de flujo carotídeo

Se midieron las velocidades de flujo carotídeo derecho e izquierdo entre el 5º y 7º días postoperatorio en todos los ratones operados, con Doppler continuo, bajo sedación con isofluorano al 2% con un ecógrafo Vivid I GE® y un transductor IL12 (4,5-11,5 MHz) por un ecografista ciego al procedimiento. Cada determinación se hizo 3 veces y los resultados se promediaron (Figura 1).

Figura 1 Figuras representativas de la velocidad de flujo máximo de ambas arterias carótidas a la segunda semana post cirugía en un ratón sham y en otro con COA. Panel superior. Velocidad de flujo máximo en cm/segundo (Doppler continuo) en arteria carótida derecha (A) y arteria carótida izquierda (B) de un ratón Sham (segunda semana post cirugía), similares en ambas arterias. Panel inferior. Velocidad de flujo máximo en cm/segundo (Doppler continuo) en arteria carótida derecha (pre-coartación, A) y arteria carótida izquierda (post-coartación, B) de un ratón COA efectivamente coartado (segunda semana post cirugía), siendo 2.5 veces mayor la velocidad en la carótida derecha (pre-coartación) que en la izquierda (post-coartación) 

Determinación tardía de la función ventricular izquierda

A la quinta semana post cirugía se realizó un ecocardiograma bidimensional bajo sedación con iso-fluorano al 2% con un ecógrafo Vivid I GE® y un transductor IL12 (4,5-11,5 MHz) con función “High fotograma rate” por un ecografista ciego al procedimiento. En el eje paraesternal izquierdo se midió grosor del septum y de la pared posterior del VI y las dimensiones de fin de sístole y de fin de diástole del VI con lo cual se calculó la fracción de acortamiento VI. La fracción de eyección se determinó por el método de Teichholz 4. Se utilizó el mismo transductor anteriormente descrito. Cada determinación se hizo 3 veces y los resultados se promediaron.

Análisis estadístico

Los valores se expresan como promedio y error estándar. Las comparaciones entre ambos grupos se realizaron con prueba de "t" para muestras independientes. Se consideró un valor de p < 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Resultados quirúrgicos y mortalidad perioperatoria

De los ratones sometidos a cirugía sham, ninguno falleció en el periodo perioperatorio (n = 6). No hubo infecciones de herida operatoria ni sepsis de otro origen en el postoperatorio.

De los 20 ratones sometidos a cirugía COA, 5 (25%) fallecieron en el periodo perioperatorio precoz antes de extubar y 3 (15%) fallecieron antes del 7º día post cirugía, con una mortalidad global de 40% en este grupo, quedando 12 ratones del grupo COA para comparación con el grupo Sham.

Evaluación precoz (segunda semana post cirugía) de las velocidades precoces de flujo carotídeo de flujo carotídeo pre y post coartación (Doppler continuo). En los ratones Sham la velocidad de flujo máximo promedio en la carótida derecha fue 45,8 ± 11,8 cm/segundo y la velocidad de flujo máximo en la carótida izquierda fue 41,2 ± 7,4 cm/segundo (NS). En cambio, en los ratones COA la velocidad de flujo máximo en la carótida izquierda (post-coartación) fue 33 ± 14,8 cm/segundo (NS con respecto a los ratones sham) y la velocidad de flujo máximo en la carótida derecha (pre-coartación) se incrementó en 2.4 veces (p<0,01) (Tabla 1 y Figura 1).

Tabla 1 Velocidad de flujo carotídeo máximo determinada precozmente por doppler continuo en ratones Sham y COA durante la segunda semana post cirugía (promedio ± ES).- 

La relación entre las velocidades de flujo máximo carotídeo derecho (pre-coartación)/carotídeo izquierdo (post-coartación) en los ratones sham fue 1,1. En cambio, la misma relación fue 2.3 veces mayor en los ratones COA (p<0.001) (Tabla 1) producto de la coartación a este nivel anatómico.

Evaluación tardía (quinta semana post cirugía) de las dimensiones, masa y función ventricular izquierda (Ecocardiogafía bidimensional,Tabla 2). En los ratones COA los grosores del septum y de la pared posterior fueron significativamente mayores (p< 0,001) que lo observado en los ratones sham reflejando la hipertrofia ventricular izquierda. Por otro lado, durante este período en el grupo COA la dimensión de fin de sístole del VI se incrementó en un 21% respecto del grupo Sham (p< 0,01). En el grupo COA se observó además un aumento significativo del 25% del diámetro auricular izquierdo y de un 18 % del diámetro de la raíz aórtica

Tabla 2 Dimensiones y Función sistólica ventricular izquierda determinadas 5 semanas después de la cirugía (promedio ± ES). 

En este modelo experimental por sobrecarga de presión del VI en los ratones COA la masa ventricular izquierda a la quinta semana fue significativamente mayor en 28% respecto de los ratones sham (p<0,05).

Respecto de la función sistólica del VI, en comparación con el grupo sham, la fracción de acortamiento en el grupo COA fue a 8 unidades de porcentaje menor (p<0,001), en tanto que la fracción de eyección fue 16 unidades porcentuales menor (p<0,001), reflejando un deterioro importante de la función contráctil del VI.

Relación entre la velocidad de flujo carotídeo determinada precozmente (segunda semana post cirugía) y la función ventricular izquierda tardía (quinta semana post cirugía) (Figura 2).

Figura 2 Relación entre el valor precoz (segunda semana post cirugía) de la razón entre velocidad de flujo carotídeo máximo derecho/ izquierdo con la evolución tardía (semana 5 post cirugía) de la fracción de eyección (FE) del VI (A) y del diámetro de fin de sístole VI (B). En el grupo COA flujo carotídeo derecho = pre-coartación y flujo carotídeo izquierdo = post-coartación. Símbolos: relleno color blanco = ratones Sham; relleno color negro= ratones COA. 

Se observó una relación inversa, estadísticamente significativa entre el aumento de la razón entre velocidad precoz de flujo carotídeo pre y post coartación y la fracción de eyección VI (r2 = 0,84, p< 0.001, Figura 2A) y a su vez una relación directa estadísticamente significativa entre el aumento de la razón velocidad precoz de flujo carotídeo pre y post coartación y el aumento del diámetro de fin de sístole VI (r2 = 0,55, p< 0.01, Figura 2B).

Discusión

El uso del modelo de coartación del arco aórtico en ratones ha sido usado ampliamente para evaluar hipertrofia ventricular izquierda e insuficiencia cardíaca en ratones. Su estandarización y posterior aplicación y validación en cada centro de investigación requiere de un trabajo importante, habitualmente multidisciplinario con el objetivo de refinar los procedimientos y optimizar los resultados.

La mortalidad intraoperatoria observada no ha sido descrita con claridad en ninguno de los artículos que hemos podido identificar en que se describe la técnica quirúrgica. Esta mortalidad es multifactorial y atribuible a múltiples situaciones. Hay riesgo inherente del procedimiento y tuvimos mortalidad por sangrados inesperados (arteria mamaria o ramas al abrir esternón o al momento del cierre, rotura aórtica al intentar rodear para realizar la coartación, etc). Hubo 1 caso de disección aórtica sin ruptura al momento de rodear la aorta y otro caso de mortalidad secundario a perforación traqueal por la cánula de intubación. Lo anterior recalca la importancia de ser sumamente cuidadosos con el manejo de tejidos en estos animales pequeños. Otros casos de mortalidad operatoria fueron secundarios a falla cardíaca aguda posiblemente por una coartación excesiva. Causas posibles de muerte operatoria no determinada pueden también ser secundarias a isquemia cerebral, mesentérica o falla multisistémica por el estrés mismo del procedimiento.

De los ratones sometidos a coartación aórtica hubo mortalidad precoz (en la primera semana) en 3 de ellos, lo que da una tasa de mortalidad de 15%. A su vez, no hubo mortalidad en los ratones sometidos a cirugía Sham.

La coartación a nivel del arco aórtico o intratorácica (entre el tronco braquiocefálico y carótida común izquierda) produjo una aceleración compensatoria del flujo a través de la carótida común derecha que fue estadísticamente significativo con respecto a la velocidad de flujo medido en las carótidas derechas de los ratones sometidos a cirugía Sham, sin con un enlentecimiento no estadísticamente significativo del flujo a nivel de la carótida común izquierda en comparación al grupo Sham. Esto confirma lo descrito por otros grupos en relación con el análisis de una coartación exitosa. Nuestra relación de 2,5 ± 0,5 difiere de otros artículos descriptivos que plantean que una coartación exitosa debe tener una relación de flujo máximo carotídeo derecha/izquierda cercanos a 6. Creemos que la posterior relación con insuficiencia cardíaca observada en nuestros ratones sometidos a coartación con los valores descritos permite crear coartaciones menos significativas que las planteadas por otros pero con resultados a largo plazo igualmente eficaces en términos de deterioro de la función sistólica VI. En esta serie, a pesar de nuestros intentos por realizar coartaciones moderadas, tuvimos mortalidad por insuficiencia cardíaca aguda. Esto fue estudiado previamente por Furihata y cols y describieron la mejor relación entre sobrevida e insuficiencia cardíaca lograda con coartaciones de 0,385 mm de diámetro.5) Es por esto que múltiples grupos han intentado estandarizar el diámetro de la coartación creada. Zhang y cols diseñaron un modelo con un clip metálico colocado usando una clipera de presión graduada de una forma estandarizada para lograr una coartación similar en todos sus ratones6.

Los resultados observados en las mediciones ecocardiografía a las 5 semanas confirman los cambios ecocardiográficos esperados para hipertrofia cardíaca con disminución de la función sistólica VI, lo que en las siguientes semanas debiera evolucionar a franca insuficiencia cardíaca con signología clínica de disnea, derrame pleural y baja de peso7.

Conclusión

En este modelo preclínico de insuficiencia cardíaca por disfunción sistólica en ratón (coartación de aorta torácica) la razón o relación entre las velocidades de flujo carotídeo pre/post coartación determinadas en forma precoz por Doppler continuo, puede predecir con bastante seguridad el curso tardío de la función sistólica ventricular izquierda y permite contar con mayor certeza inicial de la efectividad de la coartación.

Referencias

1. ROCKMAN HA, ROSS RS, HARRIS AN, KNOWLTON KU, STEINHELPER ME, FIELD LJ, et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88:8277-81. [ Links ]

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3. ZAW, A. M., WILLIAMS, C. M., LAW, H. K., CHOW, B. K. Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice. J. Vis. Exp. (121), e55293, doi:10.3791/55293 (2017). [ Links ]

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6. ZHANG, X., JAVAN, H., LI, L., SZUCSIK, A., ZHANG, R., DENG, Y., & SELZMAN, C. H. A modified murine model for the study of reverse cardiac remodelling. Experimental & Clinical Cardiology. 2013;18(2):e115-e117. [ Links ]

7. FAERBER G, et al. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: Reduced peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator levels and mitochondrial dysfunction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2011;141:492-500. doi: 10.1016/j.jtcvs.2010.03.029 [ Links ]

FONDECYT 1161739

Recibido: 08 de Diciembre de 2018; Aprobado: 10 de Diciembre de 2018

Correspondencia: Dr. Jorge E Jalil jorgejalil1956@gmail.com

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